响应面法优化复合酶提取枸杞子总黄酮的工艺研究

2017-07-13高建德朱晓玉刘雄陈晖宋开蓉师婷婷

中国中医药信息杂志 2017年7期

高建德朱晓玉刘雄陈晖宋开蓉师婷婷

摘要：目的采用响应面法优化复合酶提取枸杞子总黄酮的工艺条件。方法在单因素试验基础上，选择酶用量、酶解时间、酶解温度为因素，进行3因素3水平的中心组合设计，采用响应面法分析3个因素对枸杞子总黄酮得率的影响。结果复合酶辅助提取枸杞子总黄酮的工艺路线为：复合酶用量0.30%，酶解时间1.0 h，酶解温度60 ℃。总黄酮得率预测值为0.949 2%。结论响应面法优化复合酶辅助提取枸杞子总黄酮的方法稳定可行，操作简单，可为深入研究及应用提供依据。

关键词：响应面法；工艺优化；复合酶提取；枸杞子总黄酮

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.016

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）07-0066-06

Abstract： Objective To optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus by response surface methodology （RSM）. Methods On the basis of single-factor tests， enzyme concentration， enzymolysis time， and enzyme solution temperature were selected as influencing factors during extraction to conduct three-factor three-level center combination design. The effects of three factors on the yield of total flavonoids from Lycii Fructus were analyzed by RSM. Results The optimum conditions for extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus were enzyme concentration 0.30%， enzymolysis time 1.0 h， enzyme solution temperature 60 ℃. The predicted extraction yield of total flavonoids was 0.949 2%. Conclusion Using RSM to optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycii Fructus is stable， feasible， and simple， which can provide references for further study and application.

Key words： response surface method； technology optimization； compound enzyme extraction； total flavonoids from Lycii Fructus

枸杞子是茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实[1]，性平，味甘、微苦，无毒，具有滋养肝肾、润肺益气、生精助阳、明目等功效。黄酮类化合物是枸杞子的有效组分之一，具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、清除自由基[5]、抗炎[6]等作用。目前，黄酮类化合物的提取方法主要有回流提取法[7-8]、超声提取法[9-10]、微波辅助提取法[11]及CO2超临界流体萃取法[12]。生物酶技术具有提取效率高、

提取时间短、绿色环保及提取条件温和等优势[13]，近年来在中药黄酮类、多糖类、生物碱类等有效组分提取中均有广泛应用。生物酶辅助提取枸杞子的有效组分虽有报道，但以研究提取枸杞子多糖[14-15]为主，而在提取枸杞子黄酮类成分方面报道甚少。本研究在单因素试验的基础上，采用响应面法优化复合酶提取枸杞子总黄酮的工艺，为枸杞子的综合利用及提高黄酮类化合物的提取率提供一定的试验基础。

1 仪器与试药

UV Blue Star B型紫外-可见分光光度计（北京莱佰泰科技有限公司），DD-5M离心机（湘仪离心机仪器有限公司），AL104型电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），HH-4電热恒温水浴锅（国华电器有限公司），AKRYUP-1816超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司），PHS-3E pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

枸杞子（批号20150923），购于兰州黄河药市，经甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室杨扶德教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实；芦丁对照品（批号10080-200707），中国食品药品检定研究院；果胶酶（批号CNC1048446715）、纤维素酶（批号CNC1048447624），宁夏和氏璧生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取方法

称取枸杞子10.0 g，粉碎，过1号筛，加8倍量石油醚脱脂（2次，1.5 h/次），药渣风干。风干后的药渣装入烧杯，按照不同的酶用量、酶解温度、酶解时间，加入一定量磷酸缓冲液（pH=4.2）进行酶解提取，过滤，酶解提取后的药渣加10倍量水提取2次，1 h/次，提取液浓缩至浸膏（每1 mL浓缩液相当于0.5 g原药材），冷却，加无水乙醇至含醇量达65%，静置过夜，3500 r/min离心10 min，移取上清液5 mL置于50 mL容量瓶中，65%乙醇定容，作为待测溶液。

2.2 标准曲线制作与总黄酮得率计算

准确称取经干燥至恒重的芦丁对照品0.010 g，置于50 mL容量瓶中，加入65%乙醇溶液定容，即得芦丁对照品溶液。分别精确吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL容量瓶中，各加入65%乙醇2.0 mL，再各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，分别加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，分别加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL，摇匀，最后用65%乙醇定容，摇匀，室温放置15 min，以加入纯水、其他试剂相同的溶液为参比液，在波长510 nm处测其吸光度。以芦丁对照品溶液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，得回归方程Y=0.523X-0.010 9（r2=0.999 4）。根据回归方程计算总黄酮浓度，求得总黄酮得率（浸出总黄酮质量÷枸杞子质量×100%）。

2.3 单因素试验

2.3.1 液料比对提取效果的影响以总黄酮得率为指标，脱脂后的药渣，复合酶（果胶酶∶纤维素酶=1∶1，pH=5.31）用量0.20%，加入pH 4.2磷酸缓冲液，50 ℃酶解1.5 h，酶解后的药渣加10倍量水回流提取2次，每次1 h，考察不同液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1）对枸杞子总黄酮得率的影响，结果见图1。可见，液料比在6∶1～10∶1范围内时，枸杞子总黄酮得率随着液料比的增加而提高，呈上升趋势；液料比大于10∶1时，枸杞子总黄酮得率虽有所下降，但下降趋势不明显，基本趋于平行。故选用10∶1作为最佳液料比。

2.3.2 酶用量对提取效果的影响以枸杞子总黄酮得率为指标，50 ℃酶解1.5 h，加入pH 4.2缓冲液，考察复合酶用量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）对提取效果的影响，酶解后的药渣按液料比为10∶1，加水回流提取2次，每次1 h。结果见图2。可见，复合酶用量在0.10%～0.25%时，随着酶浓度的增加，枸杞子黄酮得率亦增大，呈上升趋势；酶用量在0.25%～0.30%时，枸杞子黄酮得率呈下降趋势，但下降幅度不大。因此，在响应面试验中选取0.15%～0.25%范围进行优化。

2.3.3 酶解温度对提取效果的影响以枸杞子总黄酮得率为指标，复合酶用量为0.20%，酶解时间为1.5 h，加入pH 4.2缓冲液，考察酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）对提取效果的影響，酶解后的药渣，按照液料比为10∶1，加水回流提取2次，每次1 h。结果见图3。可见，在温度40～50 ℃时，枸杞子黄酮得率随酶解温度的升高而呈上升趋势；在温度55 ℃时，枸杞子总黄酮得率略有下降，可能是误差所致。因此，在响应面试验中，选取40、50、60 ℃作为酶解温度的3个水平。

2.3.4 酶解时间对提取效果的影响以枸杞子总黄酮得率为指标，复合酶用量为0.20%，酶解温度50 ℃，加入pH 4.2缓冲液，考察酶解时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）对提取效果的影响，酶解后的药渣，按照液料比为10∶1，加水回流提取2次，每次1 h，结果见图4。可见，酶解时间为0.5～1.5 h时，枸杞子总黄酮得率随时间延长呈上升趋势；酶解时间为1.5～2.5 h，枸杞子总黄酮得率虽有小幅增长，但增幅并不明显。故在响应面试验中选取1、1.5、2 h作为酶解时间的3个水平。

2.3.5 pH值对提取效果的影响以枸杞子总黄酮得率为指标，复合酶用量为0.20%，在50 ℃酶解1.5 h，考察pH值（4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）对提取效果的影响，酶解后的药渣，按液料比为10∶1，加水回流提取2次，每次1 h，结果见图5。可见，pH值4.0～4.2时，总黄酮得率随着pH值增大而呈上升趋势；pH值4.4～5.2时，枸杞子总黄酮得率不再上升，反而呈下降趋势。故选用pH值4.2为宜。

2.4 响应面试验设计及结果

在单因素试验的基础上，选取3因素3水平的响应面分析试验（见表1），根据中心组合设计原理，以复合酶用量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）为自变量，枸杞子总黄酮得率为响应值进行试验分析，结果见表2。所得数据采用Design Expert 8.0软件得到回归方程：Y=0.74+0.038A+0.051B+0.072C-0.016AB-3.025×10-3AC-0.064BC+0.059A2+0.065B2-0.053C2。采用SAS RSREG回归分析对方程和方程的各个因子进行分析，结果见表3。

回归方程中各变量对响应值影响的显著性用F检验来判定，P值越小，则相应变量的显著程度越高，P<0.01时影响为极显著，P<0.05时影响为显著。通过比较方程一次项系数绝对值的大小，可以判断各因素对枸杞子总黄酮得率影响的主次顺序为C（酶解温度）>B（酶解时间）>A（酶用量）。

由表3可知，此模型P<0.000 1，表明响应面回归达到极显著水平，说明模型回归显著可靠，A（酶用量）、B（酶解时间）和C（酶解温度）对枸杞子总黄酮得率的影响极显著（P<0.01），同时，B（酶解时间）和C（酶解温度）的交互作用对枸杞子总黄酮得率影响极显著，A（酶用量）、B（酶解时间）和C（酶解温度）的平方项对枸杞子总黄酮得率的影响极显著，说明A（酶用量）、B（酶解时间）和C（酶解温度）对枸杞子总黄酮得率的影响不是简单的线性关系，平方项和交互项也具有很重要的作用，这与模型分析的结果相同。此响应面模型R2为95.93%，说明模型响应值（总黄酮得率）的变化95.93%来自所选的因变量。回归方程可以较好地描述与响应值之间的真实关系，利用此回归方程对试验结果进行计算是合理可靠的。

2.5 响应面图分析结果

通过多元回归方程所作的响应面及等高线图见图6～图8，所拟合的响应曲面和等高线图能比较直观地反映各因素间的交互作用。

由图6可知，当酶用量较低时，随酶解时间的增加，枸杞子总黄酮得率增长较快，当酶用量增大时，酶解时间越长，枸杞子黄酮得率反而会有所下降。枸杞子总黄酮得率极大值在酶用量0.15%～0.25%、酶解时间1～1.6 h。

由图7可知，酶用量不变，随着酶解温度升高，枸杞子总黄酮得率呈上升趋势，当酶解温度在40～45 ℃范围时，枸杞子总黄酮得率较高。当酶解温度恒定时，酶用量在0.15%～0.25%范围内，枸杞子总黄酮得率随着酶浓度增大而上升。

由图8可知，酶解时间不变，酶解温度对枸杞子总黄酮得率的影响呈先增后减的趋势。酶解温度恒定时，酶解时间对枸杞子总黄酮得率的影响呈现上升的趋势。枸杞子总黄酮得率的极大值在酶解时间1.0～2.0 h、酶解温度45～60 ℃。

通过以上响应面图可以直观分析各因素之间的交互作用对效应值枸杞子总黄酮得率的影响，并根据回归方程优选出枸杞子总黄酮酶解提取的最佳工艺条件为：酶用量0.30%，酶解时间1.0 h，酶解温度60 ℃。枸杞子总黄酮得率预测值为0.949 2%。

2.6 验证试验

精密称取枸杞子10.0 g，共5组，粉碎，按优化的工艺条件提取枸杞子总黄酮，测得总黄酮得率平均值为0.930 3%，RSD=0.94%。

2.7 酶解提取与传统水提法比较

分别称取枸杞子10.0 g，共6份。3份按最优的工艺条件提取枸杞子总黄酮；另外3份不加酶，以相同温度浸泡相同时间，加10倍量水，回流提取2次，1 h/次，比较2种方法的枸杞子总黄酮得率。结果见表4。可见，酶解提取法所得枸杞子总黄酮得率明显高于传统水提法，说明生物酶在60 ℃温度下仍然可以破坏枸杞子药材结构，使其总黄酮得到更有效的释放。酶解提取枸杞子总黄酮方法操作简单，工艺稳定、可行。

3 讨论

响应面法是近年来国内外常用的试验设计方法，相对于正交设计、均匀设计等试验设计方法，响应面法可以精确地找到最佳点，灵敏地考察各因素的交互作用，适用于中药材提取工艺的优选[16-17]。回归分析结果表明，酶用量、酶解时间和酶解温度对枸杞子总黄酮得率具有显著影响；提取过程中，酶解时间和酶解温度的交互作用对枸杞子总黄酮得率的影响极显著，表明这3个因素对枸杞子总黄酮得率的影响不是简单的线性关系。因此，在响应面优化试验时，酶解温度选择40、50、60 ℃这3个水平，考虑温度跨度大，运用响应面法可更好地选择枸杞子总黄酮酶解的最佳温度。

本试验优化所得的酶解温度为60 ℃，厂家提供纤维素酶的使用温度为30～60 ℃，果胶酶在60 ℃时可缩短澄清果汁的时间，说明这2种酶在60 ℃时仍具有活性。魏金莹[18]采用纤维素酶提取贝母中的贝母碱，其最优提取条件为酶解温度60 ℃、酶解时间为3.5 h，说明纤维素酶在60 ℃条件下活性可达2 h以上。

枸杞子总黄酮得率响应方程的回归分析和验证试验表明，此方法合理可行。复合酶提取枸杞子总黄酮的最佳条件为：酶用量0.30%，酶解时间1.0 h，酶解温度60 ℃。枸杞子总黄酮得率的预测值为0.949 2%，验证值为0.930 3%，与预测值的相对误差为0.018 9%。

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