孙雁霞， 李牧泽， 李 杰， 罗 倩， 时羽杰， 王跃华， 邬晓勇

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)



三角豆蛋白的提取及Osboren分类

孙雁霞， 李牧泽， 李 杰， 罗 倩， 时羽杰， 王跃华， 邬晓勇

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

以成熟干燥的三角豆为原料，采用酸沉碱提的方法进行蛋白质提取，再将提取后的蛋白分成透析蛋白和未透析蛋白两组，进行Osboren分类法分级提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，并测定分类蛋白的含量.按照Osboren分类法分级提取未透析的三角豆蛋白所得的清蛋白含量229.9 mg，球蛋白含量343.3 mg，醇溶蛋白含量66.6 mg，谷蛋白含量341.8 mg，所占比例依次为23.4%、35%、6.8%、34.8%，透析后的三角豆蛋白提取到的清蛋白含量144.2 mg，球蛋白含量341.8 mg，醇溶蛋白含量70.7 mg，谷蛋白含量328.9 mg,所占比例依次为16.3%、38.6%、8%、37.1%.

三角豆；蛋白质含量；蛋白提取；Osboren分类法

0 引 言

三角豆又名鹰嘴豆，其种植历史久远，主要分布在温暖而干燥的地区，全球各地均有种植[1-2].三角豆具有适应性强，耐旱、耐寒与耐贫瘠等特点，对病虫害的抵抗能力较强[3].由于三角豆所具有的较强耐寒性，且在植物分类上近似豆科作物苜蓿，故逐渐成为研究干旱胁迫模式的作物之一[4].研究表明，三角豆含有丰富的蛋白质、食用纤维、矿物质和不饱和脂肪酸等营养物质，还含有异黄酮和皂苷等多种生理活性物质[5-6].科研人员按蛋白质的溶解性将三角豆划分为4种类型，即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，并根据蛋白质组分在不同溶剂中的溶解性，采用蒸馏水、稀盐、乙醇、稀碱来提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白[7].本研究以成熟干燥的三角豆为材料，通过酸沉碱提方法对三角豆蛋白进行提取，然后进行Osboren蛋白质分类以及含量的测定，为进一步研究三角豆蛋白的理化性质等提供相关的实验数据.

1 材料与方法

1.1 材 料

实验所用材料为成熟干燥的三角豆.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；分光光度计(上海光学仪器公司)；pH计(上海雷磁公司)；超纯水仪(西安优普仪器设备有限公司)；磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；电子天平(上海速展机电公司)；电动粉碎机(郑州中谷机械设备有限公司)等.

1.3 试 剂

实验所用试剂包括：石油醚、NaOH、HCl、NaCl、无水乙醇、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白等，购自成都科龙化工有限公司，均为分析纯.

1.4 方 法

1.4.1 三角豆的预处理.

将三角豆用粉碎机制成粉末，取一定量的粉末加入石油醚进行两次除油，每次时间1 h.将除油后的粉末置于通风橱中挥发溶剂，得到的干燥粉末包装备用.

1.4.2 三角豆蛋白的提取方法.

称取350g的三角豆粉末，将三角豆粉末与蒸馏水混合，用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至9.6，水浴50 ℃搅拌浸提1 h，离心，收集上清液.用1 mol/L的HCl溶液将上清液的pH值调至4.0，此时，蛋白从上清液中沉淀.浑浊液用离心机在6 000 r/min下离心20 min，收集沉淀物.

1.4.3 冷冻干燥.

将所得到的沉淀物平铺于大培养皿上，分别用蒸馏水将其溶解，然后将其置于-20℃冷冻成冰备用.

1.4.4 透析除盐.

将冷冻成冰的蛋白解冻， 并对透析袋进行使用前处理后，将解冻后的蛋白溶液用超纯水进行透析，每4 h换一次水，持续24 h.将溶液分成透析液与未透析液2类，然后进行冷冻保存.

1.4.5 Osboren分级提取[7].

将透析与未透析的蛋白溶液各取一定体积，然后各自进行分级提取.实验流程如下：定量后的蛋白溶液加入10倍体积的水于40 ℃恒温搅拌2 h；10 000 r/min离心30 min，沉淀得上清液A；加入10倍体积的2.0% NaCl溶液于40 ℃恒温搅拌2 h，4 000 r/min离心30 min，沉淀得上清液B；加入10倍体积的75%乙醇溶液于40 ℃恒温搅拌2 h，4 000 r/min离心30 min，沉淀得上清液C；加入10倍体积0.01 mol/L的NaOH溶液于40 ℃恒温搅拌30 min，4 000 r/min离心30 min，得上清液D.

由于上清液A、B、C、D中分别含有三角豆清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和三角豆谷蛋白，故本实验采用考马斯亮蓝法分别测定上清液A、B、C、D中蛋白质的含量.

1.4.6 标准牛血清蛋白定制标准曲线.

配制100 μg /mL 的牛血清蛋白原液，并将此牛血清蛋白原液稀释10倍以后，在6支试管中，分别精确吸取稀释后的牛血清蛋白原液0.00 mL(空白对照)、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，用蒸馏水全部稀释至1.0 mL，然后分别加入5.00 mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，于25 ℃的恒温水浴中保温10 min，经冷水浴中冷却后，立即于分光光度计595 nm波长处比色测定.以试管中标准蛋白的总含量为横坐标，相应的吸光度值(A)为纵坐标作标准曲线图，并作线性回归，求线性方程.

1.4.7 Osboren分级蛋白吸光度的测定.

分别取水提蛋白、碱提蛋白、盐提蛋白分级提取所得到的A、B、C、D 4种蛋白质1.00 mL，加入5.00 mL考马斯亮蓝G-250溶液，混合均匀，于25 ℃的恒温水浴中保温10 min，经冷水浴中冷却后，立即于分光光度计595 nm波长处进行比色测定.

2 结果与分析

2.1 标准曲线及回归方程

按“1.4.6”项下方法，通过分光光度计在波长595 nm处测得梯度浓度蛋白溶液的吸光度值如表1.

表1 595 nm波长下蛋白标准溶液的吸光度值

根据表1数据制得标准曲线如图1所示.

图1 牛血清蛋白标准曲线

根据牛血清蛋白标准曲线可以得到回归方程，

y=0.6954x+0.0133

其中，y为吸光度，x为蛋白质浓度，线性相关系数R2=0.9992.

2.2 三角豆总蛋白含量与Osboren分级处理蛋白的含量及其比较

2.2.1 三角豆总蛋白及Osboren分级处理蛋白的吸光度值.

将冷冻后的蛋白溶液定体积分成透析与未透析蛋白先进行稀释，再进行总蛋白测定，得到蛋白OD值.结果显示，透析后的OD值为0.223，未透析的OD值为0.237.透析和未透析蛋白进行Osboren分级后4种蛋白的OD值如表2所示.

表2 595 nm波长下蛋白溶液的吸光度值

2.2.2 Osboren分级处理蛋白的含量比较.

根据考马斯亮蓝定制的标准曲线(y=0.6954x+0.0133)，将各蛋白测得的吸光度值分别代入线性回归方程求得对应蛋白的含量如表3所示.

表3 Osboren分级处理蛋白的含量(mg)

A、B、C、D分别表示的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白.从表2和表3可以看出，表2的OD值相近，但是表3含量却相差比较大，这是由于在同体积三角豆液按照Osboren分级依次提取后，为了提高准确性，在测量OD值前，将A稀释了2倍，B和D稀释了5倍，只有C没有改变.

2.3 三角豆蛋白的组成

Osboren 分级提取法是研究蛋白质常用的分类方法之一，这种方法是根据蛋白质在水、盐、醇以及碱溶液中的溶解性来划分的.但该法较粗略，只能是对结构类似的蛋白的一种大致估计.本实验对碱法提取的三角豆蛋白按Osboren分级，根据表2、表3所得数据，通过计算得知，未透析的三角豆总蛋白中清蛋白所占比例为23.4%、球蛋白为35%、醇溶蛋白为6.8%、谷蛋白为34.8%.透析过的三角豆清蛋白所占比例为16.3%、球蛋白为38.6%、醇溶蛋白为8%、谷蛋白为37.1%.不难看出，二者除了清蛋白含量有些不同之外，其他的3种蛋白不论从比例上和含量上都相差无几，并且4种蛋白含量上来看，醇溶蛋白是最少的.

3 结 论

本实验采用酸沉碱提的方法对三角豆进行蛋白质提取.按照Osboren分类法进行提取后，分别得到了三角豆清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白.由表3可以看出，未透析的清蛋白229.9 mg、球蛋白343.3 mg、醇溶蛋白66.6 mg、谷蛋白为341.8 mg，而透析过的清蛋白含量为144.2 mg、球蛋白341.8 mg、醇溶蛋白70.7 mg、谷蛋白为328.9 mg.2组数据除了清蛋白差别大以外，其他种类含量相近，这很有可能是由于对三角豆进行总蛋白提取的时候使用的碱法提取，这样使三角豆蛋白溶液中含有钠离子和氯离子，在未透析的这一组当中，所提取后的清蛋白很有可能是含有很多球蛋白，对后面的球蛋白有些影响，而经过透析的三角豆蛋白液所提取的清蛋白中所含的其他蛋白杂质更少.该法较粗略，只能是对结构类似的蛋白的一种大致估计，而且分离的蛋白质容易混杂不纯.

三角豆蛋白作为一种新型的植物蛋白资源，是一种高蛋白豆类来源，其开发与利用对缓解我国蛋白资源短缺有重要意义.利用酸沉碱提的方法可以对三角豆蛋白进行提取，且提取率较高.

[1]何妍红.鹰嘴豆营养价值及其应用[J].中国科技博览,2015，22(14):355-355.

[2]包兴国,杨蕊菊,舒秋萍.鹰嘴豆的综合开发与利用[J].草业科学,2006,23(10):34-37.

[3]Bhattarai T,Fetting S.Isolationandcharaacterizationofadehydringenefromcicerpinnatifidum,adroughtresistantwildrelativeofckpea[J].Physiol Plantar,2005,123(4):452-458.

[4]Shukla R K,Raha S,Tripathi V,et al.ExpressionofCAP2,anAPETALA2familytranscriptionfactorfromchickpea,enhancesgrowthandtolerancetodehydrationandsaltressintransgenoctobacco[J].Plant Physiol,2006,142(1):113-123.

[5]马螈,周磊,包磊.鹰嘴豆的成分分析[J].四川食品与发酵,2008,44(6):57-58.

[6]肖辉,张月明,于亚鹭.鹰嘴豆精粉对高脂大鼠的血脂代谢的影响[J].中国公共卫生,2005,21(7):843-845.

[7]Peng H,Cheng H Y,Yu X W,et al.Molecularanalysisofanactingenne,CarACT1,fromchickpea(CicerarietinumL)[J].Mol Biol Rep,2010,37(2):1081-1084.

Extraction of Triangle Beans Protein and Classification of Osboren

SUNYanxia,LIMuze,LIJie,LUOQian,SHIYujie,WANGYuehua,WUXiaoyong

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The mature and dried triangle beans were used as the raw material and the total protein from triangle beans was extracted by alkali extraction and acid precipitation method.Then the protein was classified into dialysis and non-dialysis protein groups.Each group was treated by Osboren taxonomy classification to extract albumin,globulin,gliadin and gluten protein and the contents of each protein were determined.According to Osboren classification,as for the contents of the proteins from non-dialysis,when albumin was 229.9 mg,globulin,343.3 mg,gliadin,66.6 mg and gluten，341.8 mg,the proportion was 23.4%,35%,6.8% and 34.8% respectively;meanwhile for the contents of the proteins from dialysis group,when albumin was 144.2 mg,globulin，341.8 mg,gliadin，70.7 mg and gluten，328.9 mg,the proportion was 16.3%,38.6%,8% and 37.1%,respectively.

triangle beans;protein content;protein extraction;Osboren classification

1004-5422(2017)02-0135-03

2017-01-24.

孙雁霞(1976 — )， 女， 博士， 副教授， 从事植物生物相关技术研究.

TS201.2+1；S529

A