段艳芳 (本刊记者)

科学聚焦

合成生物学的里程碑：酿酒酵母基因组合成

段艳芳 (本刊记者)

每一个物种都拥有一套独一无二的遗传信息，哪怕是结构和功能最简单的生命体，想要在实验室里“创造”出来，也曾经被认为几乎是不可能的。尽管如此，科学家从未停止对生命奥秘的探索。近年来，以“通过创造来理解”为核心理念的合成生物学快速兴起，其中一个方向即通过大规模的工程化设计和遗传操作，将人工合成的DNA序列组合拼接在一起，组装成有功能的基因组，从而创造全新的生命体[1]。

酿酒酵母基因组合成计划(Sc2.0计划)是目前正在进行中的首个真核生物基因组全合成计划，旨在重新设计并完整地合成酿酒酵母的16条染色体，并将其作为系统地研究真核生物染色体结构与功能的平台。该计划被称为Sc2.0计划，以区别于野生型酵母，其中“Sc”是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的简写。2017年3月，美国《科学》杂志以专刊的形式报道了该项目的最新进展：新合成5条完整的酵母染色体(synII、synV、synVI、synX、synXII)和一条完成一半的染色体(synIXR)，合成任务已完成1/3，从而将“Sc2.0计划”向前推进了一大步。

1 Sc2.0计划：国际合作的大科学计划

Sc2.0计划是继人类基因组计划后基因组学方面的另一项国际合作的大科学计划，也是人类首次尝试改造并从头合成真核生物的计划。该计划由纽约大学朗格尼医学中心的酵母遗传学家杰夫•伯克(Jef Boeke)发起，来自美国、中国、英国、法国、澳大利亚、新加坡等多国研究机构的200多位科学家共同参与并分工协作。

酿酒酵母是一种单细胞真核生物，也是分子生物学实验室最常用的实验材料和生命科学领域最重要的模式生物之一。作为首个完成测序的真核生物，早在1996年，包含16条染色体、约1 200万个碱基对、约6 000个基因的酿酒酵母基因组序列就已全部测序完成，为人类基因组计划的顺利实施奠定了基础。2014年，在历经长达7年的研究后，Sc2.0计划研究团队成功地合成了第一条能正常行使功能的酿酒酵母3号染色体(synIII)，标志着构建完整的真核生物基因组的历史阶段已经开启。

2017年3月，酵母基因组的重新设计工作已经全部完成，染色体合成和组装任务完成1/3。图1列出了Sc2.0计划的任务分配和完成进度，全球多家研究机构共同参与了该研究计划。根据计划，研究团队将在2017年年内完成酵母全部染色体的合成任务。

2 Sc2.0计划：中国科学家由“跟跑”到“并跑”

值得关注的是，在“Sc2.0计划”这项国际合作研究中，中国科学家发挥了重要的作用。《科学》专刊中报道的研究进展包括synII、synV、synVI、synX和synXII在内的5条完整酵母染色体的人工合成以及synIX染色体右臂(synIXR)的合成，其中中国科学家负责了大部分研究，即完成4条染色体的合成并且开发了一些新技术。

天津大学元英进教授带领研究团队完成了5号(synV)和10号(synX)染色体的化学合成。该团队通过共转化策略和CRISPR/Cas9技术修复了合成过程中的点突变，使得长为536 kb的synV合成序列与设计序列“完美”地保持一致。在人工合成长约707 kb的synX过程中，元英进团队开发了高效的染色体缺陷靶点定位技术——库RCR标签图谱(PoPM)。该技术可以鉴定出影响细胞适应度的遗传突变，并且可以推广到任何含有水印标签的人工合成基因组。

图1 Sc2.0计划染色体合成的任务分配[2]。图中标识出了酿酒酵母染色体(罗马数字所示)及其相对大小(千碱基对)，以及进行染色体合成、组装和调试的主要研究机构。黑点：染色体着丝粒的位置。蓝色：完成合成；黄色：完成设计，正在合成或组装。I和VIII纽约大学；II和VII爱丁堡大学+华大基因；III和IX约翰·霍普金斯大学；IV纽约大学+美国能源部联合基因组研究所；V和X天津大学；VI约翰·霍普金斯大学+纽约大学+金思瑞公司；XI伦敦帝国理工学院；XII清华大学；XIII华大基因；XIV麦考瑞大学+澳大利亚葡萄酒研究所；XV新加坡国立大学；XVI麦考瑞大学；tRNA新染色体：爱丁堡大学

清华大学戴俊彪研究员带领团队完成了目前已合成的最长的真核线性染色体——全长为976 kb的12号染色体(synXII)的设计与合成。天然的酿酒酵母16条染色体中，12号染色体长度最长，功能最为特殊，其长约为2.5 Mb(百万个碱基对)，含有一个约由150个重复单元组成的长约1.5 Mb的核糖体DNA(rDNA)区域。该区域形成了细胞核内一个特殊结构——核仁，是核糖体形成和组装的场所。由于synXII太长，在合成过程中，研究团队采取了分级组装策略：在6个菌株中分别完成了对染色体不同区域内源DNA的逐步替换；然后，利用酵母减数分裂过程中同源重组的特性，将多个菌株中的合成序列进行合并，从而获得完整的人工合成染色体。在synXII的组装过程中，rDNA区域首先被完整地保留下来，接着在合成染色体上被完全去除，最后在基因组3个不同的位置上利用修饰过的rDNA进行再生。

深圳华大基因研究院杨焕明院士团队联合英国爱丁堡大学团队完成了长为770 kb的2号染色体(synII)的设计、合成和鉴定，并对synII进行了深度基因型－表型关联分析。通过一系列的表型测试、结构和功能基因组分析发现，尽管存在细微差别，包含synII的菌株能够像天然菌株那样，表现出对环境的高度适应性。

从“人类基因组计划”时承担1%的测序任务，到在“Sc2.0计划”中承担重要研究工作，中国科学家更深入地参与国际科技合作。中国科学家已经由“跟跑”到“并跑”，成为该国际科技合作项目的研究主力之一。

3 Sc2.0计划：从设计到组装

基因组是指一套染色体中完整的DNA序列，既包含编码基因又包括大量非编码序列。在漫长的生物演化过程之中，作为最终调控所有生命活动的遗传物质，基因组一直处于动态变化中。基因可能会被删除、复制和插入到别的位置，能够发生重组和重排，也可能会因转座子的入侵而丧失功能。这些变化又受制于变幻莫测的自然选择，使得基因组在排列组织上并非基于空间上的有效性和经济性，而是可能基于生物演化历史中的一系列偶然事件。即便是研究最为深入的酵母，人们对其基因组的认知依然十分有限。

随着DNA合成与分析技术的迅猛发展，合成生物学正在快速兴起，从而为更深刻、更全面地了解生命提供一种全新的思路。Sc2.0计划对酵母这一研究最为透彻的真核生物的基因组蓝图进行重新组织和设计，既能深入分析染色体的结构与功能，解答生物学基本问题，同时也能够得到在医药、能源、环境、农业、工业等领域有重要应用潜力的酵母菌株。

对酿酒酵母基因组进行精心设计，是Sc2.0计划开始阶段的关键所在。野生型酿酒酵母基因组序列是设计的起点，通过BioStudio软件对基因组序列进行设计。一些通用的设计原则主要包括：①删除重复序列和绝大部分内含子序列；②将TAG终止密码子置换为TAA终止密码子；③将转运RNA(tRNA)基因移动至“新染色体”；④在全部染色体上非必需基因的3′末端引入对称型loxP位点；⑤引入可与天然DNA进行区分的PCR标签。

这些设计，力求在精简基因组、保持基因组的正常生理功能和赋予基因组一定的可变性之间取得平衡。通过删除重复或冗余序列，对酵母基因组进行了精简；为了便于大规模的工程操作而引入必需的标签序列，以便区分人工合成染色体与天然染色体；利用Cre/loxP重组系统，在人工合成染色体中引入突变和筛选机制。Cre重组酶是源于噬菌体P1的一种酶蛋白，能专一性催化两个loxP位点间的DNA进行特异性重组，导致DNA序列倒置或缺失。这样的设计，意在探索染色体重组和修饰对酵母活性和功能的影响，相当于在实验室里建立酵母快速演化的模型，体现出Sc2.0计划对酵母演化基本问题的探索。

野生型酵母基因组大小为12 071 kb。按照设计，人工合成的16条酵母染色体共有11 353 kb，删减了约6%的基因组。虽然有删减和替换，但总体上来说，依然属于对基因组比较“温和”的改变，这也是保证人工合成染色体能够具有正常生理功能的重要因素。

在组装阶段，通过一步操作将整条酵母染色体置换为人工合成的染色体太困难，因此研究团队采用逐步的、分层次的组装策略。以约750 bp的寡核苷酸为起点，将其装配成2～3 kb的小片段，再进一步装配成约10 kb的大片段。3～6个这样的片段通过限制性内切酶的酶切和连接过程组装成30～60 kb的巨区段(megachunk)。最后，利用酵母的同源重组机制，每次将长为30～60 kb的野生型基因组大片段用相对应的人工合成的区段置换出来。这样操作的好处是可以对每次同源重组的效果进行评估，若出现致死表型或者可检测到的适应缺陷可以及时纠错。即按照“设计—构建—组装—测试—学习”的循环逐步完成人工染色体的构建。每个巨区段(除了最末端一个区段)都携带一个营养缺陷型筛选标记，通过交替使用URA3和LEU2两个筛选标记，逐步完成整条染色体的装配过程。

Sc2.0计划运用工程化的手段重新装配和构建酵母的16条染色体。每条构建完成的人工染色体开始时都分散于不同的酵母菌株中，若将不同的酵母人工合成染色体整合至同一个酵母菌株，需要利用酵母的特点：不同结合型的单倍体酵母可以杂交形成二倍体，二倍体酵母在适当的培养条件下可以形成单倍体的孢子。然而，由于减数分裂过程发生多次染色体同源重组，人工合成染色体中往往含有很多天然染色体的区段，筛选含有多条完整人工合成染色体的子代细胞更是困难。为此，研究人员建立了“核内再复制杂交”(endoreduplication intercross)的方法，成功获得同时含有多条人工合成染色体的酵母菌株。图2展示了运用该方法将synIII和synIXR整合至同一酵母菌株的过程。

图2 运用核内再复制杂交方法将synIII和synIXR两条人工合成染色体整合至同一酵母菌株[2]。首先改造III和IXR两条野生型染色体的着丝粒，使着丝粒的功能既可以保持又可以被抑制；分别含有synIII和synIXR的两个酵母菌株杂交，并同时抑制III和IXR着丝粒的功能，相当于杂交后的二倍体酵母含有“2n-2”条染色体；通过酵母的核内再复制现象，两条人工合成的染色体再次复制，即形成synIII/synIII和synIXR/synIXR同源染色体，酵母染色体重新回复到2n条。含有多个合成染色体的酵母单倍体菌株通过孢子制备和分离获得

目前，研究团队已经将synII、synIII、synV、synVI、synX和synXII共六条人工合成染色体的酵母整合至同一酵母菌株，而且该酵母菌株可以像野生型酵母那样具有正常的表型和生理功能(图3)。距离构建完整真核生物基因组已经不再遥远。

图3 同时包含6条人工合成染色体的酵母具备与野生型酵母一样的正常生理功能[3]

4 Sc2.0计划：首个人造真核生物

在Sc2.0计划之前，人工合成生命体仅限于简单的细菌。2010年，克雷格•文特尔研究所合成大小为1 078 kb的丝状支原体(Mycoplasma mycoides)精简版本的基因组，并将其植入细胞，成功构建世界上首个完全人工合成生命体——JCVI-syn1.0的细菌。支原体是能够自主生活的最小的原核生物。2016年，该团队在syn1.0的基础上设计并合成了有最小基因组的自主生活生命体——仅包含473个基因的syn3.0，成为合成生物学的标志性成果之一。

Syn3.0的合成，旨在探索能够支持生命活动的最小基因组的内容是什么，而“Sc2.0计划”为在真核生物中揭示同样的问题打开了一扇门。

酿酒酵母作为单细胞的真核生物，体积比原核生物大得多，基因组信息更为庞大复杂，细胞结构也复杂得多。Sc2.0计划在复杂程度和技术难度上都非细菌人工合成可比拟的，这是科学家首次尝试改造并从头合成真核生物，成为合成生物学发展的新阶段。“改变基因组就像赌博。一个错误的变化，就可能杀死细胞，”Sc2.0计划的发起人伯克说，“而我们的酵母仍然活着，这非常重要，说明我们的合成染色体生命力顽强，赋予酵母新的属性。” “如果说基因组测序是‘读懂生命密码’，基因组合成就是在‘编写生命密码’，从读到写，是一个巨大飞跃。”华大基因理事长杨焕明院士评价说。同济大学傅继梁教授认为：“Sc2.0计划是非常有意义的一项研究，其设计体现了一种新的研究思路，在合成过程中能够促进实验技术的进步，并且在产业方面有极大的应用潜力，可以大大加快在医药、能源或环境等领域有重要应用的酵母新菌株的开发，无疑是合成生物学发展的一个里程碑，也标志着合成生物学从理论到现实的转变。”

在Sc2.0计划从设计到组装的不断试错过程中，加深对基因组的理解与认识。酵母中揭示的复杂而保守的调控机制，对其他高等生物基因组结构与功能的研究具有重要的借鉴意义。另外，大量对称型loxP位点的插入是极具创新性的研究方法。它可以通过基因组重排实现快速演化，为深入分析或者改变染色体结构与功能提供无限的可能性，也为产业上的应用奠定了基础。

(2017年4月25日收稿)

[1] 傅继梁. 基因: 探究、思辨与创新[M].上海: 上海科学技术出版社, 2016.

[2] RICHARDSON S M, MITCHELL L A, STRACQUADANIO G, et al. Design of a synthetic yeast genome [J]. Science, 2017, 355: 1040-1044.

[3] KANNAN K, GIBSON D G. Yeast genome, by design. Scientists are inching closer to generating a synthetic eukaryotic cell [J]. Science, 2017, 355: 1024-1025.

（编辑：温文）

Milestone of synthetic biology: the synthetic yeast genome project

DUAN Yanfang

10.3969/j.issn.0253-9608.2017.03.010

†通信作者，E-mail: yfduan@shu.edu.cn