张雯

摘 要：优化鱼类肠道外源乳酸杆菌DNA提取的方法。样本匀浆后加入PEG8000（40%）1000rpm离心10min，可以沉淀并去除影响DNA提取质量及抑制Real-timePCR反应的杂质。平板计数结果显示，对比未处理前样品，离心上清保留90%以上的菌液，同时杂质的去除大幅度地降低了样本的背景值。本研究为优化鱼类肠道外源乳酸杆菌定量分析体系提供理论依据。

关键词：DNA提取；前处理；微生物多样性定性定量

目前国内外对肠道乳酸杆菌的定量方法主要有培养法和免培养法。培养法主要采用对肠内容物样本平板计数法，是最原始的计数方法，易操作好掌握，成本低，但耗时长，且只能检测活菌数量。在多种免培养法中，Real-time PCR技术已广泛运用于各个领域的微生物定量中，一般步骤包括样本前处理、DNA提取、PCR计数，该方法最主要的优势为不仅可以计数活菌还可以计数死菌量，大量研究表明，死菌同样具有益生功效，通过特异性引物的设计可以达到绝对定量。

本研究旨在优化肠道外源添加乳酸杆菌定量方法体系，确定针对于鱼类肠道样本前处理的最佳方法，解决快速、准确定量鱼类肠道外源添加乳酸杆菌的计数方法。为以后深入研究菌群代谢提供技术依据。

一、材料与方法

1.材料

（1） 试验动物。

罗非鱼1.5～2.5g（贵州省罗甸罗非鱼养殖场），斑马鱼0.3～0.5g（贵州省都匀市观赏鱼市场）。正式试验进行前，试验动物均在适宜条件下暂养，确保其健康。

（2） 试验菌株。

菌株来源于中国农业科学院饲料研究所水产研究室保存菌株。……