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(广东高校油脂生物炼制工程技术研究中心,暨南大学食品科学与工程系,广东广州 510632)



羟基肉桂酸衍生物的合成及其抗氧化构效关系

单旺,陈永生,梁晓为,汪勇,晏日安*

(广东高校油脂生物炼制工程技术研究中心,暨南大学食品科学与工程系,广东广州 510632)

以羟基苯甲醛衍生物和丙二酸为原料,吡啶为溶剂,六水哌嗪为催化剂,通过Knoevenagel缩合反应合成五种羟基肉桂酸。采用熔点分析法、核磁共振氢谱法(1H Nuclear Magnetic Resonance,1H NMR)、红外光谱法(IR)、高效液相色谱法(HPLC)对产物的结构和纯度进行鉴定,结合对Fe3+还原能力、清除DPPH自由基能力等体外抗氧化方法进行抗氧化活性实验,并与羟基苯甲醛衍生物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和肉桂酸的抗氧化能力进行对比。结果表明:分别得到目标产物——3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸,纯度分别为92.45%、93.14%、99.55%、96.54%、93.50%;3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸对Fe3+还原能力、清除DPPH自由基能力较强,均高于BHT,且对DPPH自由基的IC50值(半抑制浓度)分别为(11.50±0.02)、(16.57±0.04)、(33.04±0.03) μg/mL;酚羟基是羟基肉桂酸衍生物的抗氧化活性中心,具有邻苯二酚结构或者羟基邻位存在给电子基团的衍生物,具有较高的抗氧化活性;4′位羟基取代衍生物比3′位羟基取代衍生物的抗氧化活性强;苯环上的α,β-不饱和酸共轭结构可以提高酚类化合物的抗氧化活性。

羟基苯甲醛衍生物,合成,羟基肉桂酸衍生物,抗氧化活性,构效关系

图1 羟基肉桂酸衍生物的合成路线Fig.1 Synthetic routes of hydroxycinnamic acid derivatives

羟基肉桂酸衍生物(Hydroxycinnamic acid derivatives),包括咖啡酸、阿魏酸、香豆酸和芥子酸等,广泛存在于植物中,通常以酯、糖苷的形式存在,或者与蛋白质、细胞壁聚合物相结合的形式存在,只有少部分以自由酸的形式存在于自然界[1]。羟基肉桂酸衍生物是酚酸类化合物中的一类,抗氧化活性显著,还具有降血脂、抗紫外线、止血、抗肿瘤、抗菌消炎等多种生物学活性,引起人们的广泛关注和研究[2-6]。目前,对羟基肉桂酸衍生物的研究主要集中于提取、合成及性质分析方面[7-12],而从基团种类和空间位置深入探讨其抗氧化构效关系的研究鲜有报道。

本文以五种羟基苯甲醛衍生物(3,4-二羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛、4-羟基苯甲醛、3-羟基苯甲醛)为原料,采用Knoevenagel缩合反应分别合成五种羟基肉桂酸衍生物——3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(阿魏酸)、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸(异阿魏酸)、4-羟基肉桂酸(对香豆酸)、3-羟基肉桂酸(间香豆酸)。通过熔点分析法、核磁共振氢谱法(1H Nuclear Magnetic Resonance,1H NMR)、红外光谱法(IR)、高效液相色谱法(HPLC),对羟基肉桂酸衍生物的性质、结构以及纯度进行鉴定,另外从Fe3+还原能力、清除DPPH自由基能力方面,对羟基肉桂酸衍生物的抗氧化能力进行测试,并与相应的羟基苯甲醛衍生物、BHT以及肉桂酸进行比较,旨在探究羟基肉桂酸衍生物的结构与抗氧化能力之间的关系,为新型抗氧化剂的开发和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

3,4-二羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛、4-羟基苯甲醛、3-羟基苯甲醛、DPPH(分析纯) 上海源叶生物科技有限公司;丙二酸、吡啶、铁氰化钾、三氯乙酸(分析纯) 天津市福晨化学试剂厂;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、冰乙酸、无水乙醇、甲醇(分析纯) 天津市富宇精细化工有限公司;3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、肉桂酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(分析标准品) 美国Aladdin公司。

EL104电子天平 METTLER TOLEDO有限公司;SZCL-2数显智能控温磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;PHS-3E pH计 仪电科学仪器公司;RE-52旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司;KDC-12低速离心机 科大创新股份有限公司;ZF-2三用紫外仪 上海市安亭电子仪器厂;UV-1601可见分光光度计 北京北分瑞利分析仪器公司;LC-20AD高效液相色谱仪 日本岛津公司;EQUNIOX-55型红外光谱仪 德国BRUKER公司;X-5 显微熔点测定仪 北京泰克仪器有限公司;BRUKER-500 MHz 核磁共振波谱仪 德国BRUKER公司。

1.2实验方法

1.2.1 羟基肉桂酸衍生物的合成、分离以及纯化 量取18 mL吡啶至100 mL三颈烧瓶中,再加入60 mmol丙二酸,搅拌10 min,至完全溶解,加入50 mmol羟基苯甲醛衍生物,搅拌10 min至完全溶解,加入5 mmol六水哌嗪,搅拌均匀,升温至100 ℃,回流反应2 h。反应完成后,分别加入冰水和盐酸,将反应液的pH调为2,在4 ℃下放置30 min,进行抽滤,得到一次粗产品;滤渣用乙醇溶解,进行抽滤,收集滤液旋蒸除去溶剂,得到二次粗产品;再用水/乙醇进行三次重结晶,得到终产物。合成路线如图1所示,目标产物见表1。

表1 目标化合物Table 1 Target compounds

1.2.2 产率计算 50 mmol羟基苯甲醛衍生物在反应后理论上能得到50 mmol的羟基肉桂酸衍生物，将摩尔质量转换为质量，即为理论产量y理，分别称量并记录1.2.1得到的终产物质量，为实际产量y实，产率计算公式如下：

1.2.3 熔点测定 样品熔点用显微熔点测定仪进行测定,观察样品从初熔到全熔化过程,重复三次并记录数值。

1.2.4 核磁共振波谱分析 样品溶于氘代甲醇后,用核磁共振波谱仪进行氢谱分析。

1.2.5 红外光谱分析 样品用红外光谱仪进行分析,在(4000～400 cm-1)波段进行扫描,观察记录谱峰[13]。

1.2.6 高效液相色谱分析

1.2.6.1 色谱条件 色谱柱:Waters-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为甲醇,流动相B为1%乙酸水溶液,等度洗脱(65% A,35% B);检测波长320 nm;流速为1.0 mL/min;进样量为10 μL;柱温为40 ℃。

1.2.6.2 标准品溶液的制备 分别精密称取3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸标准品,配制成500、400、300、200、100 μg/mL的甲醇溶液。

1.2.6.3 样品溶液的制备 分别精密称取3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸样品,配制成200 μg/mL的甲醇溶液,检测前再经0.45 μm滤膜过滤,即得样品溶液。

1.2.6.4 线性关系考察 标准品溶液用高效液相色谱仪进行测定,以各标准品的峰面积积分值(y)与质量浓度(x)进行线性回归,得到回归方程和相关系数。

1.2.6.5 样品纯度计算 样品溶液用高效液相色谱仪进行测定,得到各样品的峰面积积分值y1,再根据回归方程,当标准品溶液的质量浓度和样品溶液相同时,计算得出标准品的峰面积积分值y2,纯度计算公式如下:

1.2.7 羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT和肉桂酸的抗氧化活性比较

1.2.7.1 Fe3+还原能力 实验参考文献[14-16],略作修改,分别配制质量浓度为50、100、150、200 μg/mL的羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT以及肉桂酸乙醇溶液,取1 mL样液和2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH=6.6,0.2 mol/L),加入2.5 mL K3Fe(CN)6溶液(10 g/L),混合均匀,于50 ℃水浴避光反应20 min,取出加入2.5 mL三氯乙酸溶液(0.1 g/mL),3000 r/min离心10 min,取2.5 mL上清液,加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL FeCl3溶液(1 g/L),静置10 min,700 nm处测定吸光度值,空白采用蒸馏水代替样品。

1.2.7.2 DPPH自由基清除能力 实验参考文献[17-19],分别配制质量浓度为20、40、60、80 μg/mL的羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT以及肉桂酸乙醇溶液,取2 mL样品溶液和2 mL DPPH溶液(2×10-4mol/L),摇匀,30 min后于517 nm处测定其吸光度A1;同时测定2 mL不同质量浓度的样品乙醇溶液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度A2;2 mL的DPPH溶液(2×10-4mol/L)与2 mL无水乙醇混合液的吸光度A0,清除率计算公式如下:

2 结果与分析

2.1羟基肉桂酸衍生物的结构表征

化合物a:淡黄色粉末,产率：73.45%,熔点196～198 ℃。1H NMR(500 MHz,MeOD)δ 7.54(d,J=15.9 Hz,1H),7.04(d,J=2.1 Hz,1H),6.95(dd,J=8.2,2.1 Hz,1H),6.79(d,J=8.2 Hz,1H),6.23(d,J=15.9 Hz,1H)。红外光谱图如图2a所示,主要官能团的吸收峰有:IR 3430.9 cm-1(OH);1643.7 cm-1(C=O);1619.9 cm-1(反式双键C=C);1530.6 cm-1,1448.3 cm-1(苯环C-C),与3,4-二羟基肉桂酸的特征吸收峰相同。

化合物b:白色粉末,产率:65.52%,熔点172～174 ℃。1H NMR(500 MHz,MeOD)δ 7.61(d,J=15.9 Hz,1H),7.19(d,J=1.9 Hz,1H),7.08(dd,J=8.2,1.9 Hz,1H),6.82(d,J=8.2 Hz,1H),6.32(d,J=15.9 Hz,1H),3.91(s,3H)。红外光谱图如图2b所示,主要官能团的吸收峰有:IR 3437.6 cm-1(OH);2968.6 cm-1(甲基C-H);1692.7 cm-1(C=O);1619.9 cm-1(反式双键C=C);1600.7,1517.6,1466.4 cm-1(苯环C-C);1276.7,1035.4 cm-1(C-O-C),与4-羟基-3-甲氧基肉桂酸的特征吸收峰相同。

化合物c:白色粉末,产率:68.56%,熔点228～230 ℃。1H NMR(500 MHz,MeOD)δ 7.57(d,J=15.9 Hz,1H),7.08(d,J=2.1 Hz,1H),7.06(dd,J=8.3,2.1 Hz,1H),6.96(d,J=8.3 Hz,1H),6.28(d,J=15.9 Hz,1H),3.90(s,3H)。红外光谱图如图2c所示,主要官能团的吸收峰有:IR 3404.4 cm-1(OH);2943.3 cm-1(甲基C-H);1670.8 cm-1(C=O);1628.9 cm-1(反式双键C=C);1583.3,1511.9,1443.8 cm-1(苯环C-C);1264.0,1024.2 cm-1(C-O-C),与3-羟基-4-甲氧基肉桂酸的特征吸收峰相同。

化合物d:白色粉末,产率:78.61%,熔点211～213 ℃。1H NMR(500 MHz,MeOD)δ 7.61(d,J=15.9 Hz,1H),7.46(d,J=8.6 Hz,2H),6.82(d,J=8.6 Hz,2H),6.29(d,J=15.9 Hz,1H)。红外光谱图如图2d所示,主要官能团的吸收峰有:IR 3380.4 cm-1(OH);1673.2 cm-1(C=O);1627.7 cm-1(反式双键C=C);1601.4,1512.0,1448.8 cm-1(苯环C-C);832.7 cm-1(对二取代苯),与4-羟基肉桂酸的特征吸收峰相同。

化合物e:白色粉末,产率:76.22%,熔点194～196 ℃。1H NMR(500 MHz,MeOD)δ 7.60(d,J=16.0 Hz,1H),7.23(t,J=7.9 Hz,1H),7.06(d,J=7.6 Hz,1H),7.03～6.98(m,1H),6.87～6.81(m,1H),6.41(d,J=16.0 Hz,1H)。红外光谱图如图2e所示,主要官能团的吸收峰有:IR 3381.3 cm-1(OH);1670.1 cm-1(C=O);1616.1 cm-1(反式双键C=C);1499.4,451.8 cm-1(苯环C-C),与3-羟基肉桂酸的特征吸收峰相同。

图2 化合物a,b,c,d,e的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of compounds a,b,c,d,e

2.2高效液相色谱分析结果

化合物a:经过高效液相色谱分析,化合物a与3,4-二羟基肉桂酸标准品的保留时间相近(分别为8.276,8.246 min),结合结构表征结果,鉴定化合物a为目标产物3,4-二羟基肉桂酸。经计算,标准品的标准曲线回归方程为y=50911x-17761(r=0.9999),化合物a的纯度为92.45%。

化合物b:经过高效液相色谱分析,化合物b与4-羟基-3-甲氧基肉桂酸标准品的保留时间相近(分别为13.744,13.525 min),结合结构表征结果,鉴定化合物b为目标产物4-羟基-3-甲氧基肉桂酸。经计算,标准品的标准曲线回归方程为y=57013x-291289(r=0.9997),化合物b的纯度为93.14%。

化合物c:经过高效液相色谱分析,化合物c与3-羟基-4-甲氧基肉桂酸标准品的保留时间相近(分别为19.500,19.400 min),结合结构表征结果,鉴定化合物c为目标产物3-羟基-4-甲氧基肉桂酸。经计算,标准品的标准曲线回归方程为y=32283x-130844(r=0.9997),化合物c的纯度为99.55%。

化合物d:经过高效液相色谱分析,化合物d与4-羟基肉桂酸标准品的保留时间相近(分别为12.150,12.099 min),结合结构表征结果,鉴定化合物d为目标产物4-羟基肉桂酸。经计算,标准品的标准曲线回归方程为y=63433x+266911(r=0.9998),化合物d的纯度为96.54%。

化合物e:经过高效液相色谱分析,化合物e与3-羟基肉桂酸标准品的保留时间相近(分别为18.180,18.049 min),结合结构表征结果,鉴定化合物e为目标产物3-羟基肉桂酸。经计算,标准品的标准曲线回归方程为y=18102x-161756(r=0.9996),化合物e的纯度为93.50%。

2.3羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT和肉桂酸的抗氧化活性结果

图3 羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT和肉桂酸对Fe3+的还原能力Fig.3 Reducing power of hydroxycinnamic acids derivatives, hydroxy benzaldehyde derivatives,BHT,cinnamic acid on the Fe3+

2.3.1 Fe3+还原能力的比较 还原剂可将Fe3+和铁氰化物的复合物转化为Fe2+形式的化合物,从而引起700 nm处吸光值的变化,吸光值越大,则还原力越强,抗氧化能力越好[20]。由图3可以看出,羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT及肉桂酸对Fe3+的还原能力顺序为:3,4-二羟基苯甲醛>3,4-二羟基肉桂酸>4-羟基-3-甲氧基肉桂酸>BHT>3-羟基-4-甲氧基肉桂酸>4-羟基肉桂酸>4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛>3-羟基肉桂酸、肉桂酸、4-羟基苯甲醛、3-羟基苯甲醛=0。其中3,4-二羟基苯甲醛、3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸的还原能力较强,均高于BHT,而3-羟基肉桂酸、肉桂酸、4-羟基苯甲醛、3-羟基苯甲醛在实验浓度范围内未表现出对Fe3+的还原能力。

2.3.2 DPPH自由基清除能力的比较 DPPH在有机溶剂中呈紫色,在517 nm处有一较强吸收,在抗氧化剂存在下,其结构中的孤对电子被配对,吸收峰消失,DPPH的褪色程度与其所接受的电子数成定量关系,故可采用分光光度法进行定量研究[21]。由图4可以看出,羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT及肉桂酸的清除DPPH自由基活性顺序为:3,4-二羟基肉桂酸>3,4-二羟基苯甲醛>4-羟基-3-甲氧基肉桂酸>BHT>4-羟基肉桂酸、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸>3-羟基肉桂酸>肉桂酸>4-羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛、3-羟基苯甲醛。其中3,4-二羟基肉桂酸、3,4-二羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸对DPPH自由基的清除能力较强,均高于BHT,而肉桂酸和其他羟基苯甲醛衍生物的清除能力较弱。经计算,3,4-二羟基肉桂酸、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、BHT对DPPH自由基的IC50值分别为(11.50±0.02)、(16.57±0.04)、(33.04±0.03) μg/mL。

图4 羟基肉桂酸衍生物、羟基苯甲醛衍生物、BHT和肉桂酸对DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging power of hydroxy cinnamic acid derivatives, hydroxy benzaldehyde derivatives,BHT, cinnamic acid on the DPPH radical

由上述实验结果可知,具有邻苯二酚结构或者羟基邻位存在给电子基团的羟基肉桂酸衍生物具有较高的抗氧化活性;这是由于酚类化合物的抗氧化活性取决于羟基中O-H键的键能,而在羟基邻位引入给电子基团-OH,-OCH3,不但可以增加羟基上的电子云密度,还可以形成分子内氢键,从而降低O-H键的键能,使得酚羟基上的夺氢反应容易发生,这一结论已被光谱测定和理论计算所证实[22],理论计算表明:邻羟基酚氧自由基的O-H键能比其母体分子邻苯二酚强4 kcal/mol,而邻苯二酚的O-H键能比苯酚和间苯二酚分别低9.1和8.8 kcal/mol[22]。同时,邻羟基酚氧自由基由于形成分子内氢键,很容易生成比较稳定的半醌自由基,半醌自由基又可以被进一步氧化生成邻醌,从而终止氧化链反应[23],这与钱益平[24]、程锦春[25]等人的研究结果相符合。

4′位羟基取代衍生物比3′位羟基取代衍生物的抗氧化活性强;这是由于4′位羟基的键能低于3′位羟基[24],使得4′羟基更容易发生氧化反应,赵春贵[11]等人则认为是对位酚自由基的稳定性高于间位酚自由基。

苯环上的α,β-不饱和酸共轭结构可以提高酚类化合物的抗氧化活性;这是因为酚类抗氧化剂在清除自由基的过程中,会产生羟基自由基,而共轭双键可以延长苯环的共轭平面,从而有利于自由基的分散和稳定,增强酚类化合物的抗氧化活性,与黄自知[21]的研究结果相符合。

3 结论

本文对羟基肉桂酸衍生物的合成和抗氧化能力进行了研究与分析发现:酚羟基是羟基肉桂酸衍生物的抗氧化活性中心,具有邻苯二酚结构或者羟基邻位存在给电子基团的衍生物具有较高的抗氧化活性;4′位羟基取代衍生物比3′位羟基取代衍生物的抗氧化活性强;苯环上的α,β-不饱和酸共轭结构可以提高酚类化合物的抗氧化活性。

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Synthesisandantioxidantstructure-activityrelationshipsofhydroxycinnamicacidderivatives

SHANWang,CHENYong-sheng,LIANGXiao-wei,WANGYong,YANRi-an*

(Guangdong Engineering Technology Research Center for Oils and Fats Biorefinery,Department of Food Science and Engineering,Ji’nan University,Guangzhou 510632,China)

Five kinds of hydroxycinnamic acid were synthesized by Knoevenagel condensation reaction,using hydroxy benzaldehyde derivatives,malonic acid,pyridine,piperazine hexahydrate. Structural identification and purity were confirmed by melting point analysis,1H nuclear magnetic resonance(1H NMR),Infrared Spectroscopy(IR),high performance liquid Chromatography(HPLC). To evaluate its antioxidant activity,Fe3+reducing power,DPPH free radicals scavenging activity were employed,and compared with hydroxy benzaldehyde derivatives,butylated hydroxytoluene(BHT)and cinnamic acid. Results showed that the products were identified as—3,4-dihydroxycinnamic acid,4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid,3-hydroxy-4-methoxycinnamic acid,4-hydroxycinnamic acid,3-hydroxycinnamic acid,whose purity were 92.45%,93.14%,99.55%,96.54%,93.50% respectively. 3,4-dihydroxycinnamic acid,4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid had strong reducing power on the Fe3+and scavenging power on the DPPH radical,which were higher than that of BHT,and the IC50(half inhibitory concentration)of DPPH radical were(11.50±0.02),(16.57±0.04),(33.04±0.03) μg/mL. Phenolic hydroxyl group was the antioxidant activity center of hydroxycinnamic acid derivatives,and hydroxycinnamic acid derivatives which had catechol structure or the hydroxyl’s ortho-position with electron-donating group had strong antioxidant activity. 4′ hydroxy group on the benzene ring had strong antioxidant activity than 3′ hydroxy group on the benzene ring.α,β-unsaturated acid conjugate structure connected with benzene ring could improved the antioxidant activity of phenolic compounds.

hydroxy benzaldehyde derivatives;synthesis;hydroxycinnamic acids derivatives;antioxidant activity;structure-activity relationships

2017-01-10

单旺(1992-),男,硕士研究生,研究方向:食品添加剂,E-mail:shanwang_1992@163.com。

*通讯作者:晏日安(1962-),男,博士,教授,研究方向:食品添加剂的合成与应用,E-mail:yanrian813@163.com。

TS202.3

:A

:1002-0306(2017)12-0287-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.052