张仟春，杨燕群，苏 姚，栗慧敏，李明刚，吴诗琪

(兴义民族师范学院 生物与化学学院，贵州 兴义 562400)



固相微萃取/高效液相色谱联用分析食品中痕量苯并咪唑

张仟春*，杨燕群，苏 姚，栗慧敏，李明刚，吴诗琪

(兴义民族师范学院 生物与化学学院，贵州 兴义 562400)

建立了整体柱固相微萃取/高效液相色谱-紫外联用方法用于食品中6种痕量苯并咪唑的分析。在三元溶剂(N,N-二甲基甲酰胺、对二甲苯和异辛烷)体系下，以4-乙烯基苯硼酸与乙二醇二甲基丙烯酸酯原位聚合法制备了4-乙烯基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯固相微萃取整体柱，并采用热重分析仪、红外光谱、电镜进行表征。分别研究了萃取溶剂、萃取流速、净化体积、解吸溶剂、解吸流速和解吸体积对富集量的影响。在优化条件下，该方法对苯并咪唑的富集倍数高达1 607～3 015倍，方法的线性范围为0.100～100 μg/L，检出限为21～33 ng/L，相对标准偏差(RSD)不大于7.4%。采用该方法分析鱼肉、鸭肉、鸭血和鸭肝样品中的苯并咪唑，加标回收率为75.0%～118%，RSD为1.6%～8.7%。该方法灵敏、准确，能满足食品中痕量苯并咪唑的分析要求。

整体柱；固相微萃取；高效液相色谱；苯并咪唑；食品

苯并咪唑类药物(Benzimidazoles，BMZs)是一类对胃肠线虫、肺线虫等具有极强驱杀作用的驱虫药，被广泛用于农业、水产养殖和兽医中。研究表明BMZs具有致畸与致突变作用，且在体内转化的代谢产物仍具有毒理作用。目前已有许多国家将BMZs类药物列为限制使用的药物，并制订出各种BMZs类药物在不同动物体内(包括肌肉、肝脏、血液等)的最高残留限量[1-3]。目前，国内外对BMZs残留分析的前处理方法有溶剂萃取[4-5]、固相萃取[6]、搅拌饼萃取[3]等，常用的检测方法有生物免疫法[7]、毛细管电泳-质谱法[8]、液相色谱-质谱法[9-10]、液相色谱-荧光法[11]、液相色谱-紫外法[12]等，其中液相色谱-紫外法因仪器价格低和重现性好而被广泛使用。经典的固相微萃取法(Solid-phase microextraction,SPME)具有纤维萃取量有限、易断等不足，而有机聚合物整体柱SPME具有功能单体多样、萃取量大、使用寿命长等优点，在食品、环境、生物等分析中备受青睐[13-15]。4-乙烯基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯具有良好的亲水性，在水相中与分析物的π-π作用较好[16]，是绿色分析的良好富集材料。目前将4-乙烯基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体柱SPME用于食品中苯并咪唑的分析应用尚未见报道。因此，本文制备了4-乙烯基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯固相微萃取整体柱，并建立了整体柱SPME/HPLC-UV联用方法同时分析鱼肉、鸭肉、鸭血和鸭肝样品中奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑和芬苯达唑6种BMZs类药物。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1220型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，Ezchrom工作站，VWD紫外检测器;Diamonsil C18(2)色谱柱(250 mm ×4.60 mm I.D.,5 μm,迪马公司)；NICOLET AVATAR 330傅立叶红外光谱仪(美国热电公司)；NETZSCH TG-209热重分析仪(德国耐驰公司)；Hitachi S-4300电子扫描显微镜(日本Hitachi公司)；KQ-300DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；GZX-9146MBE鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；旋转蒸发器(巩义市孝义合众仪器供应站)；TGL-20M台式超速冷冻离心机(湖南星科科学仪器有限公司)；Mettler-Toledo FE20台式酸度计(瑞士梅特勒-托利公司)。

苯并咪唑标准品：奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑购自百灵威科技有限公司；色谱纯二甲基亚砜、异辛烷、对二甲苯、4-乙烯基苯硼酸(VPBA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)购自阿拉丁公司；分析纯丙酮、乙酸、溴化钾、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、偶氮二异丁腈(AIBN)购自天津大茂化学试剂厂；3-甲基丙烯酰基-丙基-三甲氧基硅烷购自北京市申达精细化工有限公司；色谱纯乙腈和甲醇购自中国迪马(Dikma)公司；320 μm石英毛细管购自河北省永年锐沣色谱器件有限公司；实验用水为超纯水。其他试剂均为分析纯。

1.2 固相微萃取柱的制备

4-乙烯基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯(VPBA-EGDMA)固相微萃取柱的制备参考文献[16]，过程略有修改：将内径为320 μm的石英毛细管洗净、烘干，然后注入1 mol/L氢氧化钠溶液于管中浸泡4 h，水洗净，再注入1 mol/L盐酸溶液浸泡2 h，水清洗后烘干，在150 ℃下活化4 h，再用丙酮/3-甲基丙烯酰基-丙基-三甲氧基硅烷(1∶3,体积比)溶液进行硅烷化反应4 h。取出后以甲醇冲洗，氮气吹干，截断成15 cm，保存于干净比色管中。称取10.0 mg VPBA和2.4 mg AIBN，溶于210 μL DMF中，加入483 μL对二甲苯、210 μL异辛烷和97 μL EGDMA，涡旋、超声均匀，室温放置30 min，取预处理好的石英毛细柱利用虹吸作用装柱，硅胶垫堵塞封口，置于(60±1.0) ℃烘箱中加热48 h，反应完成后，125 ℃下老化2 h，用乙酸-甲醇(1∶9,体积比)洗脱未反应物和溶剂，再用乙腈-水(1∶9,体积比)洗脱，然后用甲醇清洗，氮气吹干，截断为10.0 cm的VPBA-EGDMA固相微萃取柱，密封在比色管中保存备用。

1.3 固相微萃取柱的表征

将VPBA-EGDMA材料用研钵碾碎，乙酸-甲醇(1∶9,体积比)超声振荡洗去残余的未反应试剂以及致孔剂，然后在100 ℃真空干燥 12 h，采用热重分析研究VPBA-EGDMA固相微萃取柱材料的热稳定性能，从而确定其制备条件和适用温度范围，热重分析的温度范围为30～700 ℃；将VPBA-EGDMA与溴化钾混合研磨，在红外灯下干燥，观察VPBA-EGDMA的红外光谱图；将320 μm的VPBA-EGDMA固相微萃取柱截成10 mm左右，经喷金处理，采用电子扫描显微镜，在100～6 000倍率下放大，研究了VPBA-EGDMA固相微萃取柱的截面结构及形貌特征。

1.4 富集条件的研究

以二甲基亚砜-甲醇(1∶5,体积比)为溶剂配制200 mg/L的目标分析物储备液，并用甲醇稀释成20 mg/L的奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑的标准工作溶液，再用水配制成100 μg/L的水溶液，用于VPBA-EGDMA固相微萃取柱富集条件的优化。

1.5 实际样品的制备

采用含5 mg/kg苯并咪唑的大米喂养鸭子4 d，用同样含量的苯并咪唑鱼饲料喂养鱼4 d，再过3 d后屠宰。称取5.00 g均质样品于50 mL 离心管中，加入20 mL乙酸乙酯、100 μL 3 mol/L盐酸溶液和1.0 mL 1 g/100 mL 的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，置于超声波水浴中振荡5 min，加入1.0 g无水硫酸钠，均质器上匀质提取30 s，重复提取两次，合并提取液，在16 000 r/min冷冻离心5 min，清液转移至100 mL梨形瓶中，40 ℃减压旋转蒸发至干。上述残渣立即用 10 mL乙腈溶解，涡旋混匀，超声 5 min，重复萃取两次，合并乙腈相，加入质量分数为10.3%的亚铁氰化钾和质量分数为21.9%的乙酸锌各100 μL以除去蛋白质，在16 000 r/min冷冻离心 5 min；加入正己烷10 mL，涡旋混匀，弃上层正己烷，重复操作1次。旋干后加入10.0 mL水超声重溶，过0.22 μm有机相滤膜，待萃取，并进行加标验证，加标浓度为0.5 ng/g和10 ng/g。

1.6 色谱条件

色谱柱：Dikma Diamonsil C18(2)(5 μm,250 mm× 4.6 mm)；流动相为乙腈-2.5 mmol/L乙酸铵溶液；洗脱程序：30%乙腈在15 min内升至60%，保持5 min；进样量为100.00 μL；流速为1.000 mL/min；紫外检测波长为295 nm。

2 结果与讨论

2.1 固相微萃取柱结构性能研究

采用热重分析方法研究了VPBA-EGDMA微萃取柱材料的热稳定性，升温速度为10 ℃/min，在氮气氛围下测定。结果如图1A所示，VPBA-EGDMA固相微萃取柱在温度低于200 ℃时具有较好的热稳定性，在450 ℃左右柱材料基本分解完毕，因此制备VPBA-EGDMA固相微萃取柱的老化温度选择为125 ℃。

采用傅立叶变换红外吸收光谱研究了VPBA-EGDMA固相微萃取柱材料的特征功能基团。如图1B所示，3 434 cm-1处的红外吸收峰为—OH的伸缩振动峰，这是VPBA-EGDMA中的—OH特征峰；2 951 cm-1为—C—H的伸缩振动峰；1 729 cm-1为羰基的伸缩振动峰，对应EGDMA中酯的羰基峰；1 455 cm-1吸收峰对应EGDMA甲基上—CH2—键的弯曲振动；1 387 cm-1吸收峰对应B—O的伸缩振动峰，得到的红外谱图的特征峰与合成过程中加入的试剂相吻合。

通过扫描电子显微镜研究了VPBA-EGDMA固相微萃取柱的截面形貌，由图2可以看出，VPBA-EGDMA固相微萃取柱的结构疏松多孔，且具有均匀的骨架和孔分布，说明其通透性良好。

2.2 固相微萃取条件的优化

2.2.1 萃取溶剂 用100 μg/L的奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑和芬苯达唑标准溶液考察了VPBA-EGDMA固相微萃取柱在不同pH值水溶剂中的萃取量，萃取体积为5.00 mL，萃取流速为100 μL/min，解吸体积为400 μL，解吸流速为100 μL/min，净化体积为200 μL，净化流速为100 μL/min。结果如图3A所示，当pH值为7.0时，萃取效果最好，因此选择pH值为7.0的水溶液为萃取溶剂。

图3 萃取溶剂(A)与解吸溶剂(B)的优化

2.2.2 萃取流速 考察了萃取流速分别为100，150，200 μL/min时对萃取量的影响，结果显示萃取流速对萃取量的影响不大，这是因为VPBA-EGDMA固相微萃取柱的通透性良好，萃取样品溶液以渗透形式接触材料的吸附位点。考虑到压力承受范围和材料的稳定性，并缩短分析时间，实验选择200 μL/min作为最优萃取流速。

2.2.3 净化体积 采用水净化残留在VPBA-EGDMA固相微萃取柱内未被吸附的萃取溶液时，水的净化体积会影响萃取效果。为最大程度减少萃取量的损失和分析时间，考察了净化体积分别为200，300，400 μL时对萃取量的影响，结果发现净化体积为200 μL的效果较好，因此选择200 μL为最佳净化体积。

2.2.4 解吸溶剂 分别选择乙腈、乙酸-乙腈(5∶95)、甲醇、乙酸-甲醇(5∶95)作为解吸溶剂进行优化，解吸溶液体积为400 μL。结果如图3B所示，在相同条件下，甲醇解吸体系对BMZs的解吸效果明显高于乙腈解吸体系，且乙酸-甲醇(5∶95)的效果最好，故选择乙酸-甲醇(5∶95)为解吸溶剂。

2.2.5 解吸流速 解吸流速越小，解吸溶剂与分析对象的接触时间越长，更易获得较佳的解吸效果，但还需考虑分析时间。考察了解吸流速为100，150，200 μL/min时的萃取量。结果显示，100 μL/min时的解吸效果较好，因此选择最优解吸流速为100 μL/min。

2.2.6 解吸体积 考察了不同解吸体积(200,300,400,500 μL)对目标物洗脱能力的影响，结果表明，当解吸体积为400 μL时效果最好，能很好地对目标物进行洗脱，且可以节约分析时间、减少试剂使用量和获得更高的解吸液浓度，因此实验选择解吸体积为400 μL。

2.3 萃取容量的研究

以解吸溶剂中苯并咪唑的量与进样量为100 μL的100 μg/L苯并咪唑的量之比为富集倍数，考察了VPBA-EGDMA固相微萃取柱对6种苯并咪唑的富集能力，萃取浓度为400 μg/L。结果显示，奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑和芬苯达唑的萃取体积分别为48，54，72，84，90 mL时达到最大萃取容量，其值分别为16 173，20 145，25 780，27 922，29 984，30 353 ng。VPBA-EGDMA固相微萃取柱对6种苯并咪唑表现出极强的吸附能力，富集倍数高达1 607～3 015倍。

2.4 不同批次及同批次VPBA-EGDMA固相微萃取柱的萃取重现性

在优化富集条件下，用浓度为10 μg/L的奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑混合标准溶液考察了不同批次和同批次制备的VPBA-EGDMA固相微萃取柱间的萃取重现性。6种苯并咪唑不同批次柱间的相对标准偏差(RSD，n=5)为3.4%～7.6%，同批次柱间的RSD (n=5)为1.6%～5.9%，表明SPME整体柱的制备重现性较好。

2.5 分析方法的建立与应用

2.5.1 分析方法的建立 采用VPBA-EGDMA固相微萃取柱SPME/HPLC-UV联用方法测定了不同浓度的奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑混合标准溶液，根据峰面积(Y)与浓度(X)的关系拟合标准曲线方程，6种苯并咪唑的线性方程、相关系数及线性范围见表1。结果表明，分析方法具有良好的线性关系，6种苯并咪唑的线性范围为0.100～100 μg/L，相关系数(r2)均不小于0.999 1，方法的检出限(信噪比S/N=3)为21～33 ng/L。采用5.0 μg/L标准溶液考察方法的精密度，测得RSD(n=5)均不大于7.4%，表明方法具有良好的灵敏度和精密度。

表1 6种苯并咪唑的线性关系、检出限及精密度

2.5.2 实际样品的分析 采用VPBA-EGDMA固相微萃取柱SPME/HPLC-UV联用方法测定了鱼肉、鸭肉、鸭血和鸭肝中6种苯并咪唑。结果显示，各实际样品图中的基线稳定，6种目标物均能检出，图4为部分实际样品的色谱图，检测结果见表2。检测结果显示，奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑和芬苯达唑在鱼肉、鸭肉、鸭血、鸭肝中的含量分别为4.27～21.5，6.49～9.57，1.46～2.57，0.261～0.725 ng/g，而阿苯达唑和氟苯咪唑在样品中的含量均较低，其中阿苯达唑在鱼肉和鸭肉中不能定量分析，氟苯咪唑在鸭血中不能定量分析。对上述样品进行加标回收实验，加标水平分别为0.50 ng/g和10 ng/g时，各待测物的回收率为75.0%～118%，RSD为1.6%～8.7%(见表2)。

表2 食品中苯并咪唑的检测及加标实验结果(n=5)

NQ:not quantify

3 结 论

本文采用原位聚合法制备了高通透性的VPBA-EGDMA固相微萃取柱，并研究了该介质的结构性能和萃取性能。结果表明，VPBA-EGDMA固相微萃取柱具有极强的富集能力，对奥芬达唑、坎苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、阿苯达唑和芬苯达唑的富集倍数达到1 607～3 015倍。采用该介质建立了SPME/HPLC-UV联用测定6种BMZs类药物的分析方法，该法线性良好，对6种BMZs的检出限为21～33 ng/L。将所建的方法用于鱼肉、鸭肉、鸭血和鸭肝中6种BMZs的富集分析检测，样品中均检出BMZs，加标回收率为75.0%～118%，RSD为1.6%～8.7%，本法能较好满足复杂样品中痕量BMZs的分析要求。

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Determination of Trace Benzimidazoles in Foods by Solid-phase Microextraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Qian-chun*,YANG Yan-qun,SU Yao,LI Hui-min,LI Ming-gang,WU Shi-qi

(School of Biology and Chemistry,Xingyi Normal University for Nationalities,Xingyi 562400,China)

A novel method based on the monolith solid-phase microextraction(SPME) coupled with high performance liquid chromatography was developed for the determination of trace benzimidazoles in foods.The preparation of poly(vinylphenylboronic acid-co-ethylene glycol dimethacrylate) microextraction monolith based on ternary porogen was synthesized by in situ technique.The characteristics of the monolith were investigated by thermogravimetric,infrared spectroscopy and scanning electron microscopy analysis.Effects of extraction solvents，extraction velocity,purification volume,desorption solvents,desorption velocity and desorption volume on extraction amount were investigated.Under the optimal conditions,the enrichment factors of SPME monolith for benzimidazoles were in the range of 1 607-3 015.The calibration curves of benzimidazoles showed good linear relationships in the range of 0.100-100 μg/L,with detection limits of 21-33 ng/L and relative standard deviations(RSD) no more than 7.4%.The proposed method was successfully applied in the determination of benzimidazoles in fish,duck,duck blood and duck liver samples，with recoveries of 75.0%-118% and RSDs of 1.6%-8.7%.The proposed method based on SPME monolith was sensitive and accurate in the trace determination of benzimidazoles in complex samples.

monolith;solid-phase microextraction;high performance liquid chromatography(HPLC);benzimidazoles;food

2017-01-04；

2017-02-21

国家自然科学基金项目(21505115)；贵州省科学技术基金项目(黔科合LH字【2014】7406号,黔科合LH字【2016】7034号)；黔西南州科技局项目(2016-1-29)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.003

O656.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0718-07

*通讯作者：张仟春，博士，副教授，研究方向：功能材料在色谱与光谱中的应用，Tel：0859-3296359，E-mail:qianchunzhang@qq.com