赵钰玲,董 娅,范亚莉,杨拴盈,鱼 军,王娟红,王琦侠,王一理,李建英，△

1.西安交通大学医学院附属西安市中心医院(西安710003)，2.延安大学医学院(延安716000),3.西安交通大学第二附属医院呼吸内科(西安710003)，4.西安交通大学医学部基础医学院癌症研究所(西安710061)

·基础研究·

吉西他滨对人非小细胞肺癌A549、H1299细胞增殖及凋亡的影响

赵钰玲1,2,董 娅1,2,范亚莉1,2,杨拴盈3,鱼 军1,王娟红1,王琦侠1,王一理4,李建英1，4△

1.西安交通大学医学院附属西安市中心医院(西安710003)，2.延安大学医学院(延安716000),3.西安交通大学第二附属医院呼吸内科(西安710003)，4.西安交通大学医学部基础医学院癌症研究所(西安710061)

目的：研究吉西他滨对人非小细胞肺癌A549及H1299细胞增殖及凋亡的影响。方法：应用MTT法及流式细胞技术测定不同浓度的吉西他滨对A549及H1299细胞体外增殖的抑制作用。结果:①MTT法检测不同浓度(1.25、2.5、5、10、20、40、60 μg/ml)吉西他滨分别作用于A549及H1299细胞24、48、72 h后，其对A549和H1299细胞的抑制作用逐渐增强，且具有一定的剂量和时间依赖性，但是随着时间的延长，吉西他滨对A549具有药物耐受性，而对H1299具有药物敏感性；②A549及H1299细胞随着培养时间的延长，细胞生长逐渐进入对数期，后进入平台期；③倒置显微镜下观察发现，A549及H1299对照组细胞贴壁生长，生长状态良好，形态大多数为多角形、或梭形，贴壁牢固，细胞间连接紧密。随着药物作用时间的增加，细胞逐渐皱缩、坏死、碎裂；④流式细胞仪检测不同浓度的吉西他滨(0、2.5、5、10、20、40 μg/ml)对A549及H1299细胞凋亡具有明显的剂量依赖关系。结论：吉西他滨对A549及H1299细胞增殖有较强的抑制作用；呈现一定的浓度抑制作用和时间抑制作用。随着时间的延长，吉西他滨对A549细胞耐药，而对H1299细胞敏感。

目前临床上治疗非小细胞肺癌的手段包括化疗、放疗、手术及靶向治疗等，其中最为重要也最常用的手段是化疗，以铂类为基础的化疗药到目前为止仍然是晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的主流一线用药[1]。然而20世纪90年代起市场上出现了第三代细胞毒化疗药，并逐渐成为临床治疗NSCLC的一线用药。吉西他滨(Gemcitabine)是一种以破坏细胞复制的二氟核苷类抗代谢类抗癌药，是去氧胞苷的水溶性类似物，是核糖核苷酸还原酶的一种抑制性酶的替代物，这种酶在DNA合成和修复过程中，对脱氧核苷酸的生成是至关重要的。其在多种实体瘤具有良好的抗肿瘤活性，但是体外研究仍有欠缺，尤其是对不同种类的NSCLC抗肿瘤活性的对比研究尚且不多。本文就吉西他滨对非小细胞肺癌A549和H1299细胞增殖抑制及凋亡作用进行探讨。

材料与方法

1 材 料 吉西他滨(Gemcitabine hydrochloride，健泽)国药准字H20030105，生产厂家：江苏豪森药业股份有限公司。台盼蓝(TRYPAN BLUE)：MP Biomedical. LLC公司，批号MR29186。四甲基偶氮唑蓝(MTT 货号：M2128)。RPMI-1640培养基，Hyclone公司，批号ABA211779。胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批号150130)。0.25% 胰蛋白酶消化液，Solabio公司，批号20160421。二甲基亚砜(DMSO)货号D5879。Annexin V-FITV 细胞凋亡检测试剂盒，Miltenyi Biotec GmbH，货号5160412036。Multiskan Mk3酶标仪(Thermo公司)。流式细胞仪(BD FACSCalibur)。

2 实验方法 ①细胞培养：A549及H1299细胞复苏后，贴壁生长于含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI1640完全培养液中，并置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。②吉西他滨对A549及H1299细胞增殖的影响：采用MTT法，将A549按照4×103个/ml、H1299细胞按照5×103个/ml的密度分别接种到96孔培养板中，试验按不同浓度分为以下几组(1.25、2.5、5、10、20、40、60 μg/ml)、阴性对照组(加相同剂量的纯RPMI1640培养液，终体积为200 μl/孔)。分别培养24 、48、72 h后加入10 μl的MTT溶液，继续培养4 h，弃上清液，加入DMSO 150 μl，置于酶标仪上避光震荡10 min，用酶标仪测定各孔吸光度A值，测定波长490 nm，计算细胞增殖的抑制率：抑制率(%)=(阴性对照组A值-实验组A值)/阴性对照组A值×100%。③细胞生长曲线测定：取处于对数生长期的A549及H1299细胞,加入0.25%胰蛋白酶消化后用完全培养基稀释至适宜浓度，接种于7块96孔板中，每孔100 μl,设有6个复孔，细胞数为2×105个/孔，接种完成后置于37 ℃,5%CO2的恒温孵箱中培养。24 h后取出一块96孔板,每孔加入20 μl MTT溶液，再置于孵箱中继续培养4 h后取出，小心吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜200 μl，置于酶标仪上避光震荡10 min，读取并记录每孔在波长为490 nm处的光密度值，并于48、72、96、120、144、168 h各取出一块96孔板，独立重复以上操作3次，取平均值。以时间为横轴，吸光值为纵值，绘制生长曲线。④细胞形态学观察：取生长状态良好的A549及H1299细胞接种于48 孔细胞培养板内培养，吉西他滨组加入20 μg/ml的吉西他滨100 μl/孔，阴性对照组加入纯RPMI1640，培养24、48h后在倒置显微镜下观察细胞形态。⑤流式细胞术检测细胞凋亡：以每孔2 ml接种浓度A549为4×104个/ml、H1299为5×104个/ml的对数生长期细胞于6孔板中，培养箱中培养24 h。24 h后去上清液，加入含药物的培养液(2.5、5、10、20、40 μg/ml)，阴性对照组(加相同剂量的纯RPMI1640培养液)，将6孔板移入培养箱中继续培养24 h后，PBS冲洗细胞两次，胰酶消化细胞1500 r/min离心5 min，收集细胞，加1 ml 1× buffer(配置1×buffer：20倍稀释 250 μl(20×)buffer+4.75 ml蒸馏)洗涤细胞2000 r/min离心10 min，弃上清。重复上述洗涤步骤。用100 μl 1× buffer重悬细胞。加入10 μl Annexin-V FITC 抗体。避光孵育15 min。用1ml 1×buffer洗涤细胞,2000 r/min离心10 min,弃上清。重复上述洗涤步骤。用500 μl 1×buffer重悬细胞。加入5 μl 碘化丙啶(PI)，上机分析。1 h内用流式细胞仪检测细胞晚期凋亡的情况。

结 果

1 吉西他滨对 A549及H1299 细胞增殖的抑制作用 见图1～3。吉西他滨不同浓度(1.25、2.5、5、10、20、40、60 μg/ml)分别作用A549及H1299细胞24、48、72 h后，不同浓度吉西他滨在24、48、72 h对A549细胞增殖均有抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。且随着药物浓度的提高和刺激时间的延长,吉西他滨对 A549和H1299细胞的抑制作用也逐渐增强,即具有剂量和时间依赖性。但是随着时间的延长,吉西他滨对A549的抑制出现平台期,表明：A549为吉西他滨耐药型细胞，而H1299为吉西他滨敏感型细胞。

2 非小细胞肺癌A549及H1299细胞生长曲线 见图4。A549细胞所得曲线大致为直线而H1299细胞所得曲线大致为“S”型，两者在1～3 d均处于缓慢生长期，从第4天起进入对数生长期，A549细胞在第7天进入平台期，H1299细胞第6天进入平台期。

3 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察发现,A549及H1299对照组细胞贴壁生长,生长状态良好,形态大多数为多角形、或梭形，贴壁牢固，细胞间连接紧密。药物作用24 h后细胞体积变小,生长缓慢,贴壁细胞减少,细胞出现皱缩、变圆、折光性差,细胞间连接疏松。药物作用48 h后,细胞明显变圆,可见大量坏死碎裂的细胞。

4 流式细胞术检测细胞凋亡 见图5～6。吉西他滨作用24 h后，A549细胞凋亡率分别为：1.16%、3.77%、7.22%、8.75%、11.85%、15.27%；H1299细胞凋亡率分别为：0.88%、1.79%、4.40%、5.26%、8.89%、10.48%，显示出明显的剂量依赖关系(P<0.05)。

图1 吉西他滨对A549及H1299细胞作用24 h后抑制率

图2 吉西他滨对A549及H1299细胞作用48 h后抑制率

图3 吉西他滨对A549及H1299细胞作用72 h后抑制率

图4 非小细胞肺癌A549及H1299细胞生长曲线

图5 流式细胞仪检测不同浓度吉西他滨处理A549细胞后凋亡率的变化

图6 流式细胞仪检测不同浓度吉西他滨处理H1299细胞后凋亡率的变化

讨 论

吉西他滨是临床上人工合成的抗代谢类抗肿瘤药物, 属于细胞周期特异性药物，抗瘤谱广，对多种肿瘤均有显著临床疗效，具有破坏肿瘤细胞的DNA合成、阻止肿瘤细胞从G1期向S期发展、促进肿瘤细胞的DNA断裂及死亡等作用[2-4]。据报道[5]吉西他滨治疗非小细胞肺癌、胰腺癌及鼻咽癌的近期总有效率分别为42.86%，18.18%，60.00%；临床受益反应有效率分别达46.86%、45.45%、80%。本研究中我们证明了吉西他滨能抑制A549及H1299细胞增殖，诱导细胞凋亡。但是吉西他滨对H1299细胞的抑制比A549细胞高，可能是因为吉西他滨随着处理时间的延长对A549细胞出现耐药性，而对H1299细胞相对来说越来越敏感(即A549为吉西他滨耐药型细胞，而H1299为吉西他滨敏感型细胞[6])。近年来的报道显示吉西他滨的耐药机制可能由以下几种途径引起：①缺乏dCK(脱氧胞苷激酶)，这是目前研究最多，最为学者们所接受的耐药途径；②胞苷脱氨酶活性增加导致对吉西他滨的灭活增加；③聚合酶活性的变化；④细胞膜转运能力的下降引起药物进入细胞减少；⑤核苷酸还原酶增加；⑥胞浆5’核苷酶I也与吉西他滨的耐药有关；但是具体吉西他滨是通过何种途径而造成细胞耐药的仍存在很多争议。而本次研究仅为临床应用吉西他滨作为一线的化疗药物治疗非小细胞肺癌进一步提供了理论依据。最终其是通过何种凋亡途径诱导细胞凋亡，目前机制尚未明确，仍需进一步的研究验证。

[1] 尹冬梅,张红霞,韩 燕, 等.紫杉醇治疗气虚证型晚期非小细胞肺癌疗效观察[J].陕西中医,2014,35(6)：716-717.

[2] Ikeda R,Vermeulen LC,Lau E,etal.Isolation and characterization of gemcitabine-resistant human non-small cell lung cancer A549 cells[J]. Int J Oncol,2011,38：513-519.

[3] Yasui T,Ohuchida K,Zhao M,etal.Adenoviral therapy is more effective in gemcitabine-resistant pancreatic cancer than in gemcitabine-sensitive cells[J]. Anticancer Res,2011,31：1279-1287.

[4] 李梦瑶.埃罗替尼与吉西他滨不同给药方案联用的药代动力学与药效动力学研究[D].北京大学,2012.

[5] 宁亚利,姚淑莲,李东辉,等.吉西他滨治疗老年人恶性肿瘤51例[J].陕西医学杂志,2008,37(9)：1208-1210.

[6] 李晓宁,周 超,魏 丽,等.紫杉醇脂质体联合顺铂治疗中晚期肺鳞癌的疗效评价[J].西南国防医药,2015,25(1)：39-42.

(收稿：2016-10-17)

The effects of Gemcitabine in human non-small cell lung cancer A549 and H1299 cells proliferation and apoptosis

Zhao Yuling,Dong Ya,Fan Yali,et al.

Xi’an Central Hospital Affiliated of Medical College of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710003)

Objective:Study of the effects of Gemcitabine in human non-small cell lung cancer A549 and H1299 cells proliferation and apoptosis.Methods:Determined by MTT method and flow cytometry technology detect that various concentrations of Gemcitabine in A549 and H1299 cells proliferation in vitro.Results:①Determined by MTT method which detect different concentrations(1.25,2.5,5,10,20,40,60 μg/ml)of Gemcitabine in A549 and H1299 cells after 24、48、72hours.The result shows that the inhibition of A549 and H1299 cells gradually strengthened,and which has a certain dose and time dependent characteristic,but when the incubation time was prolonged,which indicates that Gemcitabine was resistant to the A549,which was sensitive to H1299 cells. ②When the incubation time was prolonged,A549 and H1299 cells gradually into the logarithmic growth period,after go in plateau. ③Observed under inverted microscope,the control group of A549 and H1299 which grow against the wall in good state.The mostly form which were diamond or spindle,those cells tightly attached and tight junctions between cells with the increase of drug effect time,cells gradually shrinking、necrosis and rupture.④How cytometry instrument detect that various concentrations of gemcitabine(0,2.5,5,10,20,40 μg/ml)in A549 and H1299 cells apoptosis has obvious dose response relationship.Conclusion：Gemcitabine has quite strong inhibitory effect on cells proliferation,which presents certain concentration dose and time dependent.With the time goes by,gemcitabine is resistant to the A549 and sensitive to H1299 cells.

Carcinoma, non-small-cell Lung Antimetabolites, antineoplastic Cell proliferation Apoptosis

*陕西省自然科学基础研究计划项目(2012JC2-06)

癌,非小细胞肺 抗代谢药,抗肿瘤 细胞增殖 细胞凋亡

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.001

陕西省科技学术研究发展计划项目(2014K11-01-02-15)

△通讯作者