李 竣，朱功俊，陈 素，刘向明，李芸芳，杨光忠

(1 中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 中南民族大学 生物医学工程学院，武汉 430074 )

HPLC法同时测定不同产地龙血竭中3种黄酮类成分

李 竣1，朱功俊1，陈 素2，刘向明2，李芸芳1，杨光忠1

(1 中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 中南民族大学 生物医学工程学院，武汉 430074 )

为建立HPLC测定不同产地龙血竭中3种黄酮类成分的方法，选择了广西、云南产9个批次的龙血竭，测定了其中龙血素A、龙血素B、剑叶龙血素B的含量. 采用Thermo BDS Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-1%冰醋酸，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温40℃，检测波长278 nm.3个药效成分在45 min内达到基线分离，线性关系良好.9个批次龙血竭中龙血素A、龙血素B、剑叶龙血素B的平均含量分别为：0.47%，0.96%，0.44%；平均加样回收率分别为：99.6%，103.2%，100.5%；RSD分别为：1.20%，0.65%，1.30%.该实验方法操作简便，结果准确，重复性和稳定性良好，可为龙血竭的质量控制提供参考.

龙血竭；龙血素A；龙血素B；剑叶龙血素B ；HPLC法

龙血竭是百合科龙血树属剑叶龙血树Dracaenacochinchinensis(Lour.) S. C. Chen的含脂的木材经提取得到的树脂[1]，主要产于东南亚和我国西南地区包括云南、广西等地.其富含有查尔酮、黄酮、高异黄烷和二苯乙烯类等成分[2]，具有活血化瘀、止血、止痛，生肌等功效，临床上用于治疗外伤出血、疮疡不敛、跌打损伤、淤滞作痛等症[3].在对龙血竭研究的过程中，发现龙血素A，B和剑叶龙血素B的配伍组合是其产生镇痛作用药效物质[4].

为了确定其3种药效物质在龙血竭中的比例关系，使用HPLC法测定其含量.目前，采用HPLC法对龙血竭进行含量测定方法有单一化合物的含量测定[5,6]，也有多个化合物的含量测定[7,8].本实验采用HPLC同时测定龙血竭中3种药效成分龙血素A、龙血素B和剑叶龙血素B的含量，对3个厂家和9个批次的龙血竭中3种药效成分进行了分析比较，为龙血竭质量控制方法提供参考依据.

1 材料

1.1 试药

龙血素A对照品(批号111660-200402)、龙血素B对照品(批号111558-201407)购于中国食品药品检定研究院，剑叶龙血素B对照品(自制，纯度≥98%).乙腈为色谱纯(Tedia company)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯.

9批龙血竭分别购自于西双版纳版纳药业有限责任公司(批号120127、111015、150702、100420)、广西中医药大学制药厂(批号20131002、20131003、20140707)和云南普洱丹州制药股份有限公司(批号20150303、20140801).

1.2 仪器

高效液相色谱仪(Ultimate 3000型, 美国戴安)，粉碎机(YB-2000A型, 浙江永康市速峰工贸),电子天平(AUW120D型,岛津)，超声波清洗器(KQ-500E型, 昆山市超声仪器)，分光光度计(UEC1312028型, 上海美谱达仪器).

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Thermo BDS Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-1%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～10 min，20%～35%A；10～35 min，35%～36%A；35～45 min，36%～37%A；流速1.0 mL·min-1；柱温40℃；检测波长278 nm.按照上述色谱条件进行测定，3个检测指标与其他峰分离良好，分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于1万.依据对3个对照品，在供试品溶液的色谱图中找到3个对照品相应的色谱峰(见图1).

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取龙血素A、龙血素B、剑叶龙血素B对照品3.71，3.05，3.86 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加适量无水乙醇超声使其溶解，并定容至刻度线，摇匀，即得到混合对照品溶液.

2.3 供试品溶液的制备

取龙血竭粉末(过60目筛)，约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密封，称定质量，室温下超声(250 W，40 kHz)提取30 min，取出放冷，再称定质量，用70%乙醇补足失重，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得龙血竭供试品溶液.

1) 剑叶龙血素B；2) 龙血素A；3) 龙血素B图1 龙血竭供试品(a)和对照品(b)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Resina Draconis and reference substances

2.4 线性关系的考察

精密量取2.2项下的混合标准品溶液1，2，3，5，7，9，10 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，按照2.1项下的色谱条件测定，记录峰面积.以对照品进样量(ng)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线回归方程，结果见表1.

表1 对照品的线性范围、回归方程和相关系数

2.5 精密度考察

精密吸取2.3项下同一浓度的供试品溶液20 μL，按照2.1项下的色谱条件，重复进样6次，测定龙血素A、龙血素B、剑叶龙血素B的色谱峰峰面积，计算其RSD分别为0.65%, 0.27%, 0.58%，表明仪器精密度良好，结果见表2.

2.6 稳定性考察

取龙血竭供试品溶液，分别于0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 h进样20 μL，按照2.1项下的色谱条件测定，并记录峰面积.龙血竭供试品溶液中的龙血素A、龙血素B和剑叶龙血素B峰面积的RSD分别为0.62%, 0.37%, 1.85%，表明供试品溶液在24 h内稳定，结果见表3.

表2 仪器精密度考察

表3 供试品稳定性考察

2.7 重复性考察

取同一批龙血竭样品，按照2.3项下的方法平行制备6份供试品溶液，进样20 μL，按照2.1项下的色谱条件测定龙血素A、龙血素B和剑叶龙血素B的含量，RSD分别为1.84%, 1.61%, 1.65%，表明该方法重复性良好，见表4.

表4 供试品重复性考察

2.8 加样回收率实验

分别精密称取已知含量的龙血竭样品6份，每份约12.5 mg，精密称定，置于具塞锥形瓶中.取2.2项下的混合对照品溶液15 mL于50 mL容量瓶中，并用无水乙醇定容至刻度线，取该溶液6份，每份5 mL，溶解上述6份龙血竭样品.室温下超声30 min后，放冷，再称定质量，用无水乙醇补足失重，取该液体用0.45 μm微孔滤膜过滤，进样量10 μL，记录对应各峰峰面积，计算3个药效成分的回收率，结果见表5.

表5 龙血竭中3个药效成分的加样回收率

2.9 样品含量测定

取不同厂家和批次的龙血竭，按2.3项下的方法制备供试品溶液，并按2.1项下的色谱条件进样分析，进样量20 μL、平行测3次，龙血竭中龙血素A、龙血素B和剑叶龙血素B的含量测定结果见表6.

表6 不同厂家和批次龙血竭中3个药效成分的测定

3 讨论

本文建立了用HPLC法同时测定龙血竭中3种药效成分的含量，该方法能使3个成分获得基线分离(分离度大于1.5)，具有快速、准确的特点.实验使用紫外-可见分光光度计分别对3个对照品溶液在190～700 nm进行了全波长扫描，结果显示：龙血素A、龙血素B和剑叶龙血素B的最大吸收波长分别为278,278,287 nm；龙血素A、龙血素B最大吸收波长一致，且剑叶龙血素B的最大吸收波长和278 nm相近，选择278 nm作为检测器的波长.

龙血素A、龙血素B具有较强的抗血栓、抗凝血等活血化瘀药理作用[9,10]，是龙血竭中重要的药效组成成分.龙血素B有良好的镇痛效应，且龙血素A、龙血素B和剑叶龙血素B有协同效应[11,12].因此本实验选择以龙血素A、龙血素B和剑叶龙血素B为考察指标.

龙血素A、B和剑叶龙血素B的联合使用与龙血竭有相同的药效作用[13]，明确这3种有效成分的含量对龙血竭质量控制十分重要.文中HPLC法测定龙血竭中3种药效成分，可为龙血竭的质量控制提供参考，保证龙血竭的临床治疗效.不同厂家和批次的龙血竭中龙血素A、B和剑叶龙血素B含量存在差异，9批龙血竭药材龙血素A、B和剑叶龙血素B的平均含量分别为0.47%,0.96%,0.44%，3种成分协同作用下治疗疼痛的比例关系，为龙血竭在药物的二次开发提供一定思路.

[1] 屠鹏飞,陶 晶,胡迎庆,等.龙血竭黄酮类成分研究[J].中国天然药物,2003,1(1):27-29.

[2] 唐人九,文东旭,韦 宏,等.广西血竭石油醚和醋酸乙酯部位中的化学成分[J].中国中药杂志,1995, 20(7):421-423,448.

[3] 王锦亮,李兴从,江东福,等.云南血竭的化学成分及抗真菌活性[J].云南植物研究,1995,17(3):336-340.

[4] Liu X M, Su C, Zhang Y, et al. Modulation of dragon′s blood on tetrodotoxin- resistant sodium currents in dorsal root ganglion neurons and identification of its material basis for efficacy[J]. Sci China Life Sci, 2006, 49(3): 274-285.

[5] 刘子修,刘 梅,刘 静,等.龙血竭胶囊中龙血素B含量的高效液相色谱法测定[J]. 海军医学杂 志,2013,34(4):249-251.

[6] 冀伟业,王东升.HPLC法测定龙血竭滴丸中龙血素B的含量[J].现代医药卫生,2010,26(7):986-988.

[7] 王佳媛,戴好富,王 辉,等.海南龙血竭HPLC分析方法及三种黄酮成分含量的测定[J].时珍国医国药,2014,12:2828-2830.

[8] 李 云,萧 伟,秦建平,等. HPLC测定龙血竭提取物中龙血素A,B和7,4′-二羟基黄酮的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(3):45-47.

[9] 杨 波,郭建恩,韩俊婷,等.龙血素A对大鼠局灶性脑缺血再灌注引起的脑损伤及机制探讨[J].中药新药与临床药理,2010,21(2):103-107.

[10] 闫 冬.龙血素B对纤溶酶原激活物抑制剂的抑制作用[J].生物化工,2016,2(2):49-50.

[11] 郭 敏,陈 素,刘向明.一种新的评估龙血竭3种化学成分相互作用特性的分析方法[J].中南民族大学学报(自然科学版),2008,27(2):56-59.

[12] Wei L S , Chen S, Huang X J , et al. Material basis for inhibition of dragon′s blood on capsaicin-induced TRPV1 receptor currents in rat dorsal root ganglion neurons[J]. Eur J Pharmacol, 2013, 702(1/3): 275-284.

[13] Chen S, Liu XM. Effect of Salvia miltiorrhiza injection on hyperpolarization-activated current channels in dorsal root ganglion neurons of rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2006, 41(11): 1038-1043.

Simultaneous Determination of Three kinds of Flavonoids inResinaDraconisfrom Different regions by HPLC

LiJun1,ZhuGongjun1,ChenSu2,LiuXiangming2,LiYunfang1,YangGuangzhong1

(1 College of Pharmaceutical Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China；2 College of Biomedical Engineering, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China )

To establish a method for the determination of loureirin A, loureirin B and cochinchinenin B inResinaDraconisfrom Guangxi and Yunnan Province in China, HPLC testing was performed on a Thermo BDS Hypersil C18column (4.6 mm×250 mm) with mobile phases of acetonitrile-1% acetic acid solution in a gradient mode, with a flow rate of 1.0 mL·min-1, column temperature of 40℃, and detection wavelength of 278 nm. The three components were baseline separated in 45 mins and showed good linear relationship. The average content of loureirin A, loureirin B and cochinchinenin B in the nine batches ofResinaDraconiswere 0.47%, 0.96%, 0.44%, and the average recover rates were 99.6% (RSD=1.20%), 103.2% (RSD=0.65%), 100.5% (RSD=1.30%), respectively. This method was convenient, accurate and reliable, which could provide reference for the quality control ofResinaDraconis.

ResinaDraconis; loureirin A; loureirin B; cochinchinenin B; HPLC

2016-11-02

李 竣(1975-)，男，副教授，博士，研究方向：天然药物化学成分及质量标准研究，E-mail：lijun-pharm@hotmail.com

国家自然科学基金资助项目(81403186)，湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划资助项目(T201220)，中央高校基本科研业务费专项(3212015CZW15029, 3212015YCZW15095)，中南民族大学实验室开放与技改资助项目(KF2016005, JG2016004)

TQ460.7+2;R927.2

A

1672-4321(2017)02-0045-04