正交试验法优选番泻叶醇提工艺※

2017-06-24杨玉琴曹青云肖顺丽关亮俊高荣凯张宏桂

河北中医 2017年5期

关键词：番泻叶乙醇溶液

杨玉琴曹青云李琦肖顺丽王敏关亮俊高荣凯张宏桂

(北京中医药大学中药学院2014级硕士研究生，北京 100102)

制剂与质量控制

正交试验法优选番泻叶醇提工艺※

杨玉琴曹青云1李琦1肖顺丽1王敏1关亮俊2高荣凯2张宏桂△

(北京中医药大学中药学院2014级硕士研究生，北京 100102)

目的优选番泻叶中番泻苷A和番泻苷B的醇提工艺。方法利用高效液相色谱法同时测定不同提取工艺后番泻叶中番泻苷A和番泻苷B的含量，并以番泻苷A和番泻苷B的含量为指标，在乙醇浓度、提取时间单因素试验的基础上设计正交试验，优选最佳的醇提工艺。结果优选出的最佳提取工艺为：醇浓度70%，液料比1∶15，提取时间15 min，提取次数2次。结论优选出的最佳提取工艺提取率高、稳定性好，可为番泻叶的工业化生产工艺提供指导。

番泻叶(中药)；番泻叶提取物；正交试验

番泻叶为豆科植物狭叶番泻(CassiaangustifoliaVahl)或尖叶番泻(CassiaacutifoliaLelile)的干燥小叶，其性寒，味甘、苦，归大肠经，具有泻热导滞、利水通便等功效，用于治疗热结积滞、便秘腹痛、水肿胀满等病症[1]，现代临床广泛应用于治疗便秘[2-3]、腹部术后恢复[4]、腹部X线摄片和手术前清洁肠道[5]。现代药理研究显示，番泻叶主要含有蒽醌、黄酮、挥发油、多糖等化学成分[6]，其中蒽醌类成分番泻苷A、B是治疗便秘的主要有效成分。为优化番泻苷A、B的提取工艺，便于工业化生产，本研究采用不同浓度的乙醇作为提取溶剂，以番泻苷A、B为指标进行单因素和正交试验，对番泻叶的醇提工艺进行研究。

1 试药和仪器

1.1 试药番泻叶饮片购自河北安国药材市场，批号20160407，经检验符合《中华人民共和国药典》标准。番泻苷A、B对照品(98%)，购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。1.2 仪器 Waters 1525型高效液相色谱仪，Breeze2色谱工作站，Waters 2489型紫外可见检测器，色谱柱Sunfire TM C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，美国Waters公司；真空旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵，上海振捷实验设备有限公司；电子恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；舒美KQ-300VDB超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 番泻苷A、B含量测定2.1.1 色谱条件色谱柱：Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸(79∶21)为流动相；检测波长为271 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量10 μL。理论板数按番泻苷A峰计算应不低于4 000，理论板数按番泻苷B峰计算应不低于6 500。2.1.2 溶液制备番泻苷A对照品溶液制备：精密称取105 ℃干燥至恒质量的番泻苷A对照品0.003 3 g于25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解定容刻度，配制成0.132 mg/mL的番泻苷A对照品溶液。番泻苷B对照品溶液制备：精密称取105 ℃干燥至恒质量的番泻苷B对照品0.004 0 g于20 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解定容刻度，配制成0.2 mg/mL的番泻苷B对照品溶液。番泻苷A、B混标对照品溶液制备：精密吸取番泻苷A、B对照品溶液各200 μL，制成番泻苷A、B混标溶液。2.1.3 标准曲线绘制精密吸取番泻苷A、B混标对照品溶液0.625、1.875、3.125、4.375、5.000 mL于5 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，配制成番泻苷A浓度分别为0.016 5、0.049 5、0.082 5、0.115 5、0.132 0 μg/μL，番泻苷B浓度分别为0.025、0.075、0.125、0.175、0.200 μg/μL的溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，分别吸取10 μL进入高效液相色谱仪，在271 nm波长下检测，记录番泻苷A、B的峰面积。以峰面积为纵坐标，番泻苷A对照品溶液浓度(μg/μL)为横坐标，绘制标准曲线得番泻苷A标准曲线回归方程为：Y=1×107X+4 529.7(R=0.999 7，n=5)，式中Y为吸光度，X为浓度(μg/μL)，结果表明：番泻苷A在0.016 5～0.1320 μg/μL范围内呈良好的线性关系(见表1，图1)。以峰面积为纵坐标，番泻苷B对照品溶液浓度(μg /μL)为横坐标，绘制标准曲线得番泻苷B标准曲线回归方程为：Y=2×107X+34 383(R=0.999 9，n=5)，结果表明：番泻苷B在0.025～0.200 μg/μL范围内呈良好的线性关系(见表2，图2)。

表1 番泻苷A线性关系考察结果 (n=5)

图1 番泻苷A标准曲线图

(n=5)

2.1.4 供试品溶液制备取番泻叶提取物干膏，研细，精密称取0.25 g试样，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1%碳酸氢钠溶液50 mL，称定质量，超声处理15 min(30～40 ℃)，放冷，再称定质量，用0.1%碳酸氢钠溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

图2 番泻苷B标准曲线图

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度的选择综合文献参考，在确定提取时间为15 min，提取次数为1次的情况下，取6份番泻叶饮片各10 g，分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇各200 mL，根据其番泻苷A和番泻苷B的含量选择合适的乙醇浓度。见表3，图3。

表3 乙醇浓度对番泻苷A、B提取的影响

图3 乙醇浓度对番泻苷A、B提取的影响

由表3、图3可见，随着乙醇浓度的不断增加，番泻苷的综合评价指数也逐渐增加，当乙醇浓度增加到70%以后，综合评价指数达到最大，所以正交试验选择60%、70%、80%3个乙醇浓度。

2.2.2 提取时间的选择综合文献参考，在确定提取乙醇浓度为70%，提取次数为1次的情况下，取6份番泻叶饮片各10 g，分别提取5、10、15、20、25、30 min，根据番泻苷A和番泻苷B的含量选择合适的提取时间，结果见表4、图4。

表4 提取时间对番泻苷A、B提取的影响

图4 提取时间对番泻苷A、B提取的影响

由表4、图4可见，随着提取时间的不断增加，番泻苷的综合评价指数先增加后降低。当提取时间到10 min时，综合评价指数达到最大，所以正交试验选择5、10、15 min 3个时间。

2.3 正交试验设计在确定了提取乙醇浓度

(A)、提取时间(C)的基础上，对影响提取的其它主要因素乙醇倍量(B)、提取次数(D)进行正交试验优选，每次试验称取干燥的番泻叶饮片10 g，通过L9(34)正交表进行试验设计，因素水平设计见表5。

表5 L9(34)番泻苷A、B提取试验正交设计表

按照L9(34)正交表及以上测量方法，测得每组试验中番泻苷A、B的含量，评分时以各指标的最大量为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重。番泻苷A、B的权重系数分别设为0.5。以综合值进行统计分析，结果见表6，方差分析见表7。其中综合评分Y=0.5×X×100/2.02+0.5×Y×100/2.35。

表6 番泻苷A、B正交试验及结果

表7 番泻苷A、B正交试验方差分析

从正交试验结果表及方差分析表可以看出：各因素作用的主次顺序依次为乙醇浓度、溶剂倍量、提取时间、提取次数，即A>B>C>D。方差分析表显示A、B、C因素差异显著(P<0.05)，D因素差异不显著(P>0.05)。由直观分析，A因素中A2>A1>A3，故选择A2；B因素中B1>B2>B3，故选B1；C因素中C3>C1>C2，故选C3；D因素中，三水平间差异不明显，在A2、B1、C3条件下，将番泻叶提取2次与3次进行比较，番泻苷A和番泻苷B的含量没有升高，为了节约时间和成本，综合考虑提取次数定为2次，即D2。由此可推出，正交试验所得的最佳工艺条件为A2B1C3D2，即乙醇浓度为70%，液料比为1∶15，提取时间为15 min，提取次数为2次。

2.4 最佳提取工艺验证试验按照以上结果分析的最佳工艺，分别各取3批番泻叶饮片进行试验，比较和验证最佳提取工艺的可靠性，结果见表8。

表8 最佳提取工艺验证试验结果

由表8可见，在最佳提取工艺条件下所得的综合评价指数与正交试验结果相当，因此可以说明优选出的提取工艺稳定，合理，可行。

3 讨论

近年来，随着中医药研究现代化、药材资源产业化的发展，中药的应用范围越来越广泛。番泻叶因具有泻热行滞、通便利水的功效，现代临床多用于术前清洁肠道、治疗便秘等。因番泻叶泻下的主要成分为番泻苷A、B，故本试验以番泻苷A、B来计有效成分的含量，优选出最佳的番泻苷A、B的提取工艺。传统对番泻苷类化合物的提取多采用沸水煎煮、沸水浸泡、醇回流及超声等。如王文莉等[7]采用超声波水提取番泻叶中番泻总苷，优化工艺为提取温度95 ℃，提取时间15 min，超声波频率40 kHz,该法提取总番泻苷为其含量的99.1%。曹蔚等[8]用10倍50%乙醇为溶剂，室温浸提24 h，每次提取2次，验证番泻苷A提取率为91.2% (n=4)。本试验以番泻苷A、B含量为指标，在乙醇浓度、提取时间单因素试验的基础上，设计四因素三水平的正交试验，最终确定了最佳提取工艺为：70%的乙醇，1∶15的液料比，提取时间为15 min，提取次数为2次。本试验得出的最佳提取工艺可靠稳定，可为番泻苷的相关研究和实际生产提供依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2015：347.

[2] 相小燕.番泻叶浸剂灌肠治疗产后便秘的疗效观察[J].海峡药学，2009，21(8)：139-140.

[3] 张宝梅，赵爱民.番泻叶治疗老年患者便秘的效果观察[J].齐齐哈尔医学院学报，2003，24(2)：151-152.

[4] 李俊峰，张翼凤，武稚雅.番泻叶与开塞露用于剖宫产术后促排气的临床疗效对比及护理要点[J].包头医学院学报，2008，24(5)：518-519.

[5] 朱水永.番泻叶用于肠道清除120例的临床观察[J].海峡药学，2006，18(2)：138-139.

[6] 吴丹，郑学宝.番泻叶的研究概况[J].亚太传统医药，2008，4(11)：151-153.

[7] 王文莉，俞作仁，汤浩，等.用正交试验研究番泻叶中总番泻苷的超声提取工艺[J].中南药学，2003，1(3)：162-163.

[8] 曹蔚，李教社，李小强，等.番泻叶的提取工艺研究[J].中草药，2005，36(7)：1019-1021.

(本文编辑：曹志娟)

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.05.033

※ 项目来源：国家自然科学基金资助项目(编号：30870262)

杨玉琴(1989—)，女，硕士研究生在读。研究方向：中药有效物质基础研究。