王 建， 辛 良， 武沛泽， 王宏钧， 范庆增,， 薛宝君， 温会文， 刘福林， 范 开， 常建宇

(1.天津市中升挑战生物科技有限公司 ， 天津西青300380 ； 2.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193)

恩诺沙星对肉仔鸡胫骨关节软骨的影响

王 建1， 辛 良2， 武沛泽2， 王宏钧2， 范庆增1,2， 薛宝君1， 温会文2， 刘福林2， 范 开2， 常建宇2

(1.天津市中升挑战生物科技有限公司 ， 天津西青300380 ； 2.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193)

为了探究氟喹诺酮类药物恩诺沙星对禽类胫骨发育的影响，以恩诺沙星为研究对象，选取雄性肉鸡鸡雏，随机分成5组，分别为空白组、10 mg/kg体重组、30 mg/kg体重组、60 mg/kg体重组、100 mg/kg体重组，每组36只，于1日龄和7日龄进行相应的给药处理，在7、14、21、28、35、42 d每组随机抽取6只肉鸡，取部分胫骨关节软骨做组织切片用，观察胫骨关节软骨组织结构变化并记录关节软骨细胞数量，评价胫骨关节软骨的发育情况。结果表明，恩诺沙星对肉鸡胫骨关节软骨的组织结构影响不显著，静止区软骨细胞和肥大区软骨细胞在不同生长时期时，不同剂量恩诺沙星对其细胞数量影响差异不显著。

恩诺沙星 ； 肉仔鸡 ； 关节软骨毒性

喹诺酮类药物是指一类具有4-喹诺酮环结构的药物，在临床治疗中已成为很多感染性疾病的首选药物，使用频率仅次于青霉素类[1]。喹诺酮类药物同其他抗生素一样，也存在药物不良反应，通常表现在血液系统反应、消化系统反应、中枢神经系统症状、过敏反应、肝肾脏器损害等[2]，但对幼年动物的负重关节、软骨的损害也不容忽视。结合临床症状和文献报道，在临床上使用喹诺酮类药物后引起犬猫后肢瘫痪的原因，主要表现在此类药物对幼年犬猫的负重关节及关节软骨的影响；且在动物试验中发现，其关节损伤的发生及损伤程度均与喹诺酮类药物用药剂量呈正相关[3]。Machida等观察喹诺酮类药物对幼年动物的毒性作用，结果发现兔、鼠、犬均可发生关节病变[4]。

目前对禽类的软骨毒性尚不清楚，在肉鸡养殖业中如果氟喹诺酮类药物如恩诺沙星等使用是否会加大对肉鸡胫骨软骨发育的影响尚不清楚。本试验拟采用肉鸡养殖中的恩诺沙星给药规程，通过加大恩诺沙星的给药剂量，探讨恩诺沙星对快速生长的肉鸡的生长性能以及关节软骨的发育影响。

1 试验材料

Leica RM2235手轮转切片机，KD-BL包埋机冷冻台，KD-P摊片机，KD-BM生物组织包埋机，QB-2000烘片机，YLE-1000电热恒温水浴锅，CX21倒置式研究型显微镜，Harris苏木素染液，伊红染液，切片石蜡，环保透明剂Van-Clear，GS封片胶，10×PBS缓冲液

2 试验步骤

2.1 本试验采取单因子随机试验设计，将5组的雏鸡按照下表对应的给药剂量进行给药。其中肌肉注射的低(A)、中(B)、高(C)、超高(D)剂量组分别于1日龄和7日龄按相应剂量肌肉注射给药1次，空白对照组于1日龄和7日龄肌肉注射生理盐水1次，每次0.5 mL/只。

表1 分组设计

注：肌肉注射的部位是雏鸡的左腿

2.2 每组分别在第7、14、21、28、35、42天随机抓取6只，分离鸡只左侧胫骨，生理盐水清洗，用刀片取小块软骨组织浸泡在10%福尔马林溶液中，进行脱钙处理。

2.3 制作胫骨软骨组织切片，并进行H.E.染色。

2.4 软骨细胞数量统计：每组6个切片中分别在10倍物镜下观测切片并拍照，每张切片选取相应静止区与肥大区，于40倍物镜下拍照，摄片结果经Image Pro Plus软件下统计各图中软骨细胞数量，以剂量组为单位，求各组平均值。

3 试验结果

3.1 不同剂量恩诺沙星对肉仔鸡胫骨关节软骨静止区软骨细胞数的影响 不同剂量恩诺沙星第1周时对肉仔鸡胫骨软骨静止区软骨细胞的数量影响组间差异不显著(P<0.05)；第2周时，不同剂量恩诺星对肉仔鸡胫骨软骨静止区软骨细胞数量影响差异显著(P<0.05)，10 mg/kg体重组比30 mg/kg体重、60 mg/kg体重、100 mg/kg体重和空白组分别高8.12%、11.46%、15.25%、11.89%，10 mg/kg体重组静止区软骨细胞数量显著高于100 mg/kg体重组(P<0.05)，与其余组差异不显著(P>0.05)，不同剂量组呈现出随着剂量升高细胞数量下降的趋势；第3周时，30 mg/kg体重组比100 mg/kg体重组高14.35%，差异显著(P<0.05)，其余各组差异不显著，不同剂量组之间呈现出随着剂量上升细胞数量先上升后下降的趋势；第4周时，不同剂量恩诺沙星与空白组对肉仔鸡胫骨软骨静止区软骨细胞数量的影响差异显著(P<0.05)，10 mg/kg体重、30 mg/kg体重组与60 mg/kg体重、100 mg/kg体重组相比，差异显著(P<0.05)，不同剂量组间呈现出随着剂量的增加细胞数量先升高后降低的趋势；第5周时，不同剂量组恩诺沙星对肉仔鸡胫骨软骨静止区细胞数量影响显著，60 mg/kg体重组比10 mg/kg体重、30 mg/kg体重、100 mg/kg体重，空白组分别低8.12%、7.43%、6.69%、12.1%，差异显著(P<0.05),组间差异显著性水平下降；第6周时，不同剂量恩诺沙星与空白组对肉仔鸡胫骨软骨发育影响组间差异不显著(P>0.05)。

3.2 不同剂量恩诺沙星对肉仔鸡胫骨关节软骨肥大区软骨细胞数量的影响 第1周时，不同剂量恩诺沙星与空白组对肉仔鸡胫骨软骨肥大区细胞数量影响差异显著(P<0.05)，30 mg/kg体重组比100 mg/kg体重组软骨细胞数量高14.8%，差异显著(P<0.05)，其余各组与100 mg/kg体重、30 mg/kg体重组差异不显著(P>0.05)，细胞数量位于两者之间；第2周时，不同剂量恩诺沙星与空白组对肉仔鸡胫骨软骨肥大区细胞数量的影响组间差异显著(P<0.05)，100 mg/kg体重组比10 mg/kg体重、30 mg/kg体重及空白组软骨细胞数量低，分别为8.14%、10.39%，相比差异显著(P<0.05)；第3周时，不同剂量恩诺沙星与空白组对肉仔鸡胫骨软骨肥大区细胞数量影响组间差异显著(P<0.05)，10 mg/kg体重、30 mg/kg体重与空白组比100 mg/kg体重组分别高8.16%、7.45%、10.56%，相比差异显著(P<0.05)；第4周时，不同剂量恩诺沙星与空白组对肉仔鸡胫骨软骨细胞数量的影响组间差异显著(P<0.05)，60 mg/kg体重、100 mg/kg体重比空白组胫骨软骨细胞数量低8.09%、8.12%，相比差异显著(P<0.05)；第5周与第6周时，不同剂量恩诺沙星对肉仔鸡胫骨软骨肥大区软骨细胞数量的影响组间差异均不显著(P>0.05)。

3.3 H.E.染色观察不同剂量恩诺沙星对肉仔鸡胫骨软骨的组织结构的影响 鸡胫骨关节软骨组织切片H.E.染色结果表明，在不同生长时期中的空白对照组关节软骨都表现为软骨表面光滑，关节软骨细胞排列正常，层次分明，结构清楚，基质正常，软骨膜结构完整，静止区同源软骨细胞均匀分布，软骨囊明显，着色较深；增殖区软骨细胞密集，与静止区及前肥大区界限明显，细胞呈长梭形，垂直于胫骨长轴，前肥大区软骨细胞大量分化为肥大区软骨细胞，细胞形态由长梭形逐渐转变成为圆形，同时细胞体积变大，细胞胞浆丰富，钙化区肥大软骨细胞正常钙化，骨小梁周围少见未完全钙化的软骨细胞。

在不同生长时期的肉鸡胫骨关节软骨组织结构与空白对照组肉鸡胫骨关节软骨组织结构并无明显的区别，表现为软骨表面比较光滑，关节软骨细胞排列较正常，层次较清楚，在60 mg/kg体重组以及100 mg/kg体重组有时可见软骨膜增厚，基质着色在高剂量时可见基质着色轻微变淡，软骨膜结构完整，静止区同源软骨细胞分布较均匀且细胞数量存在如3.1中所描述的变化情况，软骨囊较明显，着色深；增殖区软骨细胞密集，与静止区及前肥大区界限相比空白对照组略有不明显，细胞呈长梭形，垂直于胫骨长轴，前肥大区软骨细胞大量分化为肥大区软骨细胞，细胞数量存在如3.2中所描述变化情况，细胞形态由长梭形逐渐转变成为圆形，同时细胞体积变大，细胞胞浆丰富，钙化区肥大软骨细胞数量较多，骨小梁周围可见一定数量未完全钙化的肥大软骨细胞。

4 讨论

氟喹诺酮类药物的软骨毒已经在诸多哺乳动物的药物试验中得到证实，试验证明氟喹诺酮类药物具有软骨毒性，而且动物年龄越小，毒性越明显，越严重。氟喹诺酮类药物的软骨毒性作用机理尚不清楚，但有比较流行的几个假说。Stahlmannr等[5]认为，氟喹诺酮类因其化学结构中镁离子的螯合性从而影响了局部镁离子的浓度，进而影响了软骨细胞表面B1整合素的正常功能，引起软骨细胞的损伤，而幼龄动物处在骨生长期，需要大量镁离子的参与软骨的增殖和分化，近些年研究也表明了氟喹诺酮的使用与低镁摄入对软骨的损伤具有协同的作用[5-7]。也有研究表明，氟喹诺酮类药物引起软骨损伤的分子机制可能与软骨细胞内活性氧(H2O2)的增加有关，过量生成的H2O2使细胞外的基质成分如胶原、透明质酸酶的结构被破坏[8]，从而诱发软骨损伤。

对相同动物的不同软骨存在差别，通过文献我们可以知道，对不同软骨的毒性存在以下规律：膝关节软骨>髋关节软骨>腕关节软骨，是由于不同关节软骨的负荷不同而导致的，来自于后天的关节活动频率和受力大小，而并非是氟喹诺酮类药物对不同关节软骨的毒性作用不同，对不同动物相对部位软骨的软骨毒性存在差别，具有以下的规律：犬>大鼠>兔>猪>猴[9]，可能与生长速度和受力大小和关节活动频率综合相关，而人的关节软骨毒性并没有犬等哺乳动物明显，可能是因为相对于犬、猪等哺乳动物，人的生长速度明显更慢，而且人在用药时用量更精确也更谨慎。

在本试验设计时，由于肉鸡属于禽类，氟喹诺酮类药物具有种属特异性，并无相关的文献证明禽的软骨毒性。对于肉鸡，它具有生长速度快的特点，42 d便可以出栏，从负荷角度以及生长速度来讲，禽类的软骨毒性应该容易显现，同时我们选择敏感性最强的关节软骨作为组织结构变化的观测对象，具有放大效果。但肉鸡活动性小，多静卧，关节活动少，受力也因此减少。两方面综合来看，肉鸡关节软骨毒性的显现并未可知。从本次试验结果得知，10～100 mg/kg体重恩诺沙星正常给药对肉鸡胫骨关节软骨的组织结构至出栏时影响不显著。

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2016-08-09

王建(1970-)，男，高级兽医师，硕士，主要从事兽药的研发、生产及销售管理工作，E-mail：wangjian5555@163.com

范开，E-mail：dirtyfan@sina.com；常建宇，E-mail：changjianyu@cau.edu.cn

S859.79+6

B

0529-6005(2017)05-0104-03