李雪嵩 ， 董文龙 ， 王 羽 ， 张红伟 ， 张喜庆 ， 马红霞 ， 高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118)

山羊源伪中间葡萄球菌的分离鉴定及耐药性检测

李雪嵩 ， 董文龙 ， 王 羽 ， 张红伟 ， 张喜庆 ， 马红霞 ， 高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春130118)

伪中间葡萄球菌是一种常见的致病菌，多引起宠物不同程度感染。2016年3月初，吉林省某羊场育肥羊出现零星死亡，病羊主要表现为呼吸系统症状。采集病羊呼吸系统各器官，以进行细菌的分离、培养。分离菌株经培养特性、染色镜检、生化试验及16S rDNA序列分析，确定为伪中间葡萄球菌，其对小鼠有致病性。对分离到的菌株通过微量稀释法进行药物敏感性测定，结果显示，对庆大霉素、链霉素、红霉素、阿莫西林、头孢氨苄、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星、强力霉素耐药；对阿米卡星、氟苯尼考、环丙沙星敏感。

山羊 ； 伪中间葡萄球菌 ； 分离鉴定 ； MIC

Correspouding author:GAO Yun-hang

伪中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius，SP.)是2005年由Devriese等[1]发现并命名的，它是一种新的凝固酶阳性葡萄球菌，可引起宠物犬、猫等多种感染性疾病，如犬脓皮病、伤口感染、外耳道炎以及尿道感染等[2]。2016年3月初，吉林省某山羊场育肥羊发生以呼吸道症状为主的疾病，病羊出现零星死亡。作者从病死羊内脏分离得到1株细菌，通过鉴定，确定为伪中间葡萄球菌。本研究对分离出的伪中间葡萄球菌进行了药敏试验，以期对由该菌引起的疾病在临床治疗和用药方面起到一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 病料来源 吉林省某养殖场发病山羊，剖检取病变呼吸系统各器官，进行病原微生物分离培养。

1.2 培养基及试剂 TSA固体培养基、胎牛血清、TSB液体培养。DNA Marker DL-2 000、10×Buffer、d NTP Mixtur、ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T vector、96孔细胞培养板、切胶回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)服务有限公司。磺胺间甲氧嘧啶、头孢氨苄、阿奇霉素、恩诺沙星、力霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、红霉素、氟苯尼考、阿莫西林、环丙沙星等12种抗菌药物，均购自北京海洋医药化工生物科技有限公司。

1.3 实验动物 16只健康体重30 g昆明系小鼠，购自吉林大学实验动物中心。

1.4 细菌的分离培养 在超净工作台里无菌分离病原菌，分别接种于麦康凯琼脂培养基和TSA固体培养基(含5%胎牛血清)上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察细菌生长状态及菌落形态。

1.5 涂片镜检 用接种环挑取上述培养得到的单个菌落进行革兰染色，随后镜检。

1.6 生化鉴定 取上述的24 h纯培养物分别接种到PYR、V-P、甘露醇、精氨酸、木糖、棉子糖、七叶苷、麦芽糖、蕈糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇培养基内，37 ℃培养24 h，观察结果并记录。试验结果参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行对比。

1.7 动物致病性试验 挑取纯培养物的单个菌落，接种于TSB液体培养基(含5%胎牛血清)，37 ℃摇菌18～24 h。所得菌液分别接种8只健康实验小鼠，腹腔注射菌悬浮液0.2 mL/只。选用8只健康小鼠腹腔注射0.2 mL TSB液体培养基，作为阴性对照。观察死亡情况，剖检死亡小鼠，观察病变，采集病料并进行细菌分离培养。

1.8 分离菌株16S rDNA基因序列测定 取1.6 mL培养菌液12 000 r/min离心10 min，收集菌体，按照Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)提取DNA，提取到的基因组作为16S rDNA基因PCR扩增模板。根据GenBank数据库查询，用Primer6.0设计16S rDNA引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′；下游引物：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′。反应体系：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 3.0 μL，dNTP 2.0 μL，Ex Taq 0.2 μL，上游引物 1 μL，取2.5 μL PCR扩增产物与0.4 μL 6×Loading Buffer(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)混合后经1%琼脂糖凝胶电泳检测。随后将得到的PCR产物切胶回收，连接，转化，提取质粒，将纯化质粒直接送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。

1.9 构建系统进化树 将16S rDNA测序结果与GenBank数据库中已知的相关核酸序列进行Blast分析比对，并采用MEGA 5.05软件构建系统进化树。

1.10 药敏试验 选用兽医临床上较为常见的12种抗菌药物，分别为强力霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、红霉素、氟苯尼考、阿莫西林、环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶、头孢氨苄、阿奇霉素和恩诺沙星。采用微量稀释法进行最小抑菌浓度(MIC值)的测定。结果参照美国临床和实验室标准协会[3]的标准，判定其耐药情况。

2 结果

2.1 细菌的分离培养 麦康凯琼脂培养基上生长缓慢。在TSA固体培养基(含5%胎牛血清)生长出淡灰色、圆形、光滑、隆起、边缘整齐的菌落(见中插彩版图1)。

2.2 涂片镜检 在油镜下观察为革兰阳性，球菌，单个或呈串状排列(见中插彩版图2)。

2.3 生化鉴定 生化试验结果表明， V-P、精氨酸、木糖、棉子糖、七叶苷、山梨醇为阴性反应，而PYR、麦芽糖、蕈糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇为阳性反应，此结果符合伪中间葡萄球菌的生化特性。

2.4 动物致病性试验 对照组死亡率为0%，试验组的死亡率为75%。剖检死亡的小鼠并采集肺脏，进行细菌分离培养和生化试验，能够得到与原分离菌株一致的病原菌。

2.5 16S rDNA基因扩增结果 以提取到的DNA为模版，利用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，结果如图3所示，得到的条带大小约为1 500 bp，与预期大小相符，证明扩增成功。

图3 16S rDNA扩增结果

M：DNA分子质量标准； 1：SP. 16S rDNA 的PCR 产物； P：表示对照菌株； N：表示阴性对照菌株

2.6 系统进化树构建 扩增产物的核苷酸序列大小为1 512 bp，测序结果在GenBank数据库中进行Blast分析比对并与葡萄菌属的其他种建立进化树(图4)，结果显示，该分离菌株与伪中间葡萄球菌(登录号CP002439.2)同在一个分支，表明该分离菌株为伪中间葡萄球菌。

图4 SP.株与相关菌株的系统发育树

2.7 药敏试验结果 各种药物的浓度测试范围并分析MIC结果，根据美国临床和实验室标准协会的标准，得出以下结果：如表1所示，本试验分离的伪中间葡萄球菌对庆大霉素、链霉素、红霉素、阿莫西林、头孢氨苄、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星、强力霉素耐药；对阿奇霉素处于中介；对阿米卡星、氟苯尼考、环丙沙星敏感。

表1 药敏试验判定结果与判定标准

3 讨论

本试验结果表明，该羊场育肥羊发病的主要原因是感染了伪中间葡萄球菌，从而引起了系列呼吸系统症状。通过临床诊断、流行病学调查和实验室诊断，排除了病毒感染和寄生虫感染所导致死亡的可能。通过16S rDNA基因分析以及生化特性可以将分离菌株鉴定为伪中间葡萄球菌。伪中间葡萄球菌作为一类重要的动物性细菌病的病原菌，在国内外已发表的文献中，未见从山羊体内分离得到过的报道，本研究首次从羊体内分离得到伪中间葡萄球菌，表明在这种跨物种传播趋势愈演愈烈的情况下，兽医临床不可忽视病原微生物的跨物种传播及变异将对养殖业带来的潜在威胁[4]。

药敏试验结果表明，该分离菌对阿莫西林和头孢氨苄表现为耐药，而阿莫西林和头孢氨苄皆属于β-内酰胺类抗生素，抗菌谱与青霉素相同[5]，对革兰阳性球菌和杆菌作用强，所以认为该养殖场在平时饲养中对羊常用青霉素类抗生素，从而使分离菌株对阿莫西林和头孢氨苄耐药。对阿米卡星、氟苯尼考、环丙沙星敏感，可选择敏感药物进行治疗。对伪中间葡萄球菌治疗较困难，其原因是对抗生素的耐药范围逐渐增大。Microbiol等人在2012年发表了相关研究，表明伪中间葡萄球菌对9种抗生素耐药，这9种药多为氨基糖苷类[6]，这也与本文所得结果相近。当然通过药敏试验所选择的敏感类药物在临床应用中也未必取得较好疗效，因为具体治疗过程中存在太多的不确定性，要采取科学合理的治疗手段才能取得好的疗效[7]。

对于本病的治疗，最重要的就是改善饲养管理，严格实行兽医卫生监督体系，提高动物体的抵抗力能有效的预防本病传染，加强圈舍环境卫生，提高饲养员防控意识，完善肉羊繁殖过程中的饲养程序，以获取更高的总经济价值。

[1] Devriese L A, Vancanneyt M, Baele M,etal.Staphylococcuspseudintermediussp. nov., a coagulase-positive specieces from animals[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2005, 55: 1569-1573.

[2] 韩涛, 张晓, 吴欣,等. 貂感染伪中间葡萄球菌的诊断及药敏试验[J]. 经济动物学报, 2014, 18(1):11-14.

[3] 廖延雄. 《伯杰氏鉴定细菌学手册》与《伯杰氏分类细菌学手册》[J]. 微生物学通报, 1992(4)：59.

[4] 董文龙, 王琦, 王巍,等. 山羊源犊牛摩拉菌的分离与鉴定[J]. 中国兽医科学, 2016，46(2):198-202.

[5] Sandhu T S. Fecal streptococcal infection of com-merical white pekin ducklings [J]. Acain Dis, 1988, 32: 570-573.

[6] Casagrande Proietti P , Bietta A, Coletti M,etal. Insertion sequence IS256 in canine pyoderma isolates of Staphylococcus pseudintermedius associated with antibiotic resestance [J]. Vet Microbiol, 2012, 157: 376-382.

[7] 裴志花, 孙小宁, 王开. 1株羊肺源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(6): 220-223.

Isolation,Identification and Drug Resistance ofStaphylococcus

pseudintermediusIsolated from Goat

(Animal Science and Technology College, Jilin Agriculture University, Jilin 130118, China)

Staphylococcuspseudintermediusis a common pathogenic bacterium which causes different extent infection in pets. At the beginning of March in 2016, a small number of goat deaths appeared in Jilin province, and the respiratory symptom was the main symptom of the diseased goat. Each organs of the respiratory system were collected from diseased goats for bacterial isolation and cultivation. According to the analysis of the isolated bacteria by characteristics, staining microscopy, biochemical experiment, and 16S rDNA sequence, the bacteria was identified to beStaphylococcuspseudintermediusand was highly pathogenic to mice. Drug sensitivity was performed with the isolated strains through the micro-dilution method. The isolated strains were tested with the method of micro-dilution to identify their sensitivity to medicine, and the results showed that they Were to Cerant to gentamicin, streptomycin, erythromycin, amoxicillin, sulfamonomethoxine, enrofloxacin and doxycyclin and sensitive to amikacin, florfenicol, ciprofloxacin and chloramphenicol.

Goat ;Staphylococcuspseudintermedius; Isolation and identification ; MIC

2016-11-10

吉林省现代农业产业技术体系建设专项(2015-24);吉林省动物疾病防治研究创新团队(20111820); 国家科技支撑计划项目(2014BAK19B005)

李雪嵩(1994-)，男(蒙古族)，硕士生，主要从事动物疫病防治工作，E-mail：372238174@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com

S858.27

A

0529-6005(2017)05-0098-03