郭 岑 ， 李欣然 ， 李晓蕾 ， 李亚楠 ， 李丽娜 ， 王宇鑫 ， 张一鸣 ， 王 浩 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

咪达唑仑对小型猪不同脑区氨基酸类神经递质的影响

郭 岑 ， 李欣然 ， 李晓蕾 ， 李亚楠 ， 李丽娜 ， 王宇鑫 ， 张一鸣 ， 王 浩 ， 高 利

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

为了研究咪达唑仑对小型猪各脑区氨基酸类神经递质的影响，探讨咪达唑仑的中枢麻醉机制，将20只小型猪随机分为4组，分别为对照组、诱导组、麻醉组和恢复组。连续观察小型猪行为学变化，并于相应时间点采取脑组织，通过高效液相色谱(HPLC)法检测天冬氨酸(ASP)、谷氨酸(GLU)、甘氨酸(GLY)、氨基丁酸(GABA)的含量。结果显示，咪达唑仑的麻醉机制与抑制脑干内兴奋性神经递质释放和促进大脑和小脑内抑制性神经递质释放相关。

咪达唑仑 ； 小型猪 ； 氨基酸类神经递质 ； 麻醉

咪达唑仑作为新一代苯二氮卓类药物，临床疗效较好，不良反应较轻，常用作抗焦虑、催眠、镇静[1]，在兽医临床多与其他药物合用来增强效果[2-3]。氨基酸类神经递质是中枢神经系统内重要的一类神经递质，在认知、神经元损伤和中枢疲劳等生理病理过程起关键作用。许多学者在使用麻醉药物后，检测氨基酸类神经递质含量的变化趋势，以探究不同麻醉药物对氨基酸类神经递质的影响。因此，本试验拟研究咪达唑仑对小型猪不同脑区氨基酸类神经递质的影响，探讨其可能的中枢麻醉作用机制，为咪达唑仑临床使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 Waters 600高效液相色谱仪，色谱柱Symmetry C18 (4.6×150 mm，5 μm)；甘氨酸(GLY)标准品(Sigma,109K0107)；L-谷氨酸(L-GLU)标准品(Sigma,BCBB5881)；天冬氨酸(ASP)标准品(Sigma,129K0181)；γ-氨基丁酸(GABA)标准品(Sigma,0001446172)；色谱级甲醇；色谱级乙腈。

1.2 实验动物分组 实验用巴马小型猪20只，7～8 月龄，雌雄兼有，体重 32.2±4.3 kg，健康状况良好。由东北农业大学外科教研室从三元猪场购入2头成年公猪和8头成年母猪自行繁育而得。随机分为对照组、诱导组、麻醉组和恢复组共4个试验组，每组5只。

1.3 脑组织样品采取 对照组肌肉注射生理盐水(0.2 mL/kg体重)处死后立即取脑组织，试验组肌肉注射咪达唑仑(0.2mL/kg体重)后，根据小型猪行为学变化分别于小型猪倒地不起(诱导组)、翻正反射消失(麻醉组)、翻正反射恢复(恢复组)后处死，立即取脑组织，用冷藏后生理盐水冲洗，并迅速于冰面上依次分离大脑皮层、海马、脑干、小脑和丘脑，液氮冷冻，-80 ℃保存。

1.4 RP-HPLC检测氨基酸神经递质方法的建立 取脑组织制备匀浆液，4 ℃低温离心取上清液400 μL。流动相C为0.05 mol/L的醋酸钠缓冲液(pH值=6.5)，B为乙腈/水(V/V=50∶50)，进行梯度洗脱，流动相C的浓度由初始时65%经10 min至10%，18 min至40%；流速0.6 mL/min；检测波长360 nm；柱温28 ℃的色谱行为进行高效液相色谱-荧光检测。取20 μL进样分析，采用外标法定量，以测定4种氨基酸类神经递质浓度。

1.5 数据分析 用平均值±标准差表示数据。所有结果通过SPSS 19数据分析系统做单因素方差分析，P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 咪达唑仑麻醉后小型猪不同脑区ASP的含量 如表1所示，大脑和海马内ASP含量在诱导期与对照组相比上升68%，差异极显著(P<0.01)，18%差异不显著(P>0.05)；恢复期含量接近正常水平。丘脑、小脑ASP含量则在诱导期与对照组相比下降36%和24%，差异极显著(P<0.01)；麻醉期和恢复期含量回升且高于正常水平，其中丘脑恢复期含量与对照组相比差异显著(P<0.05)。脑干内ASP含量在麻醉期与对照组相比下降37%，差异极显著(P<0.01)；恢复期含量仍低于正常水平且差异极显著(P<0.01)。

表1 咪达唑仑麻醉下小型猪不同脑区ASP的含量变化 (μg/mL)

注：各组与对照组差异用*表示，*：与对照组比较差异显著，P<0.05；**：与对照组比较差异极显著P<0.01。各组与诱导组差异用#表示，#：与诱导组比较差异显著，P<0.05；##：与诱导组比较差异极显著，P<0.01，下表同

2.2 咪达唑仑麻醉后小型猪不同脑区GLU的含量 如表2所示：各脑区GLU含量在诱导期升至最高；麻醉期降至最低，麻醉期GLU含量与对照组相比分别下降15%、20%、4%、9%和37%，除丘脑外均差异显著(P<0.01或P<0.05)。大脑、海马、丘脑和小脑内GLU含量在恢复期均恢复至正常水平；脑干内GLU含量在恢复期低于正常水平，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

表2 咪达唑仑麻醉下小型猪不同脑区GLU的含量变化 (μg/mL)

2.3 咪达唑仑麻醉后小型猪不同脑区GLY的含量 如表3所示，大脑、海马、小脑和脑干内GLY含量在诱导期与对照组相比分别上升69%、63%、50%，差异显著(P<0.05)，3%差异不显著(P>0.05)；麻醉期和恢复期含量接近正常水平，差异不显著(P>0.05)。丘脑内GLY含量与对照组相比，在麻醉期上升74%，差异显著(P<0.05)；恢复期含量下降但高于正常水平，差异不显著(P>0.05)。

表3 咪达唑仑麻醉下小型猪不同脑区GLY的含量变化 (μg/mL)

2.4 咪达唑仑麻醉后小型猪不同脑区GABA的含量 如表4所示，大脑、小脑和脑干内GABA含量在诱导期与对照组相比分别上升61%、16%和52%，差异显著(P<0.01或P<0.05)；麻醉期和恢复期含量下降，接近正常水平。海马内GABA含量在诱导期与对照组相比上升13%，差异不显著(P>0.05)；麻醉期含量与对照组相比下降23%，差异显著(P<0.05)；恢复期含量回升。丘脑内 GABA 含量在麻醉期与对照组相比下降29%，差异显著(P<0.05)；恢复期含量回升并接近正常水平。

表4 咪达唑仑麻醉下小型猪不同脑区GABA的含量变化 (μg/mL)

3 讨论

目前，大量研究表明，多数麻醉药可通过直接或间接作用来改变中枢神经系统中不同氨基酸类神经递质的含量，从而引起相应受体功能改变来发挥全麻机制。GLU在大脑发育、学习记忆、长时程增强及神经元可塑性等方面均起重要作用[4-5]。全麻药可能通过抑制GLU与NMDA受体的结合，同时降低GLU突触前膜的释放，并增强GLU在突触间隙的摄取，来调节谷氨酸能神经元的兴奋性而产生麻醉效应。王恒林等[6]通过建立NMDA诱导的PC12细胞损伤模型，使用不同剂量的咪达唑仑进行处理，经测定后发现，只有GLU含量较对照组明显降低，由此证明，咪达唑仑可抑制MNDA诱导的PC12细胞损伤导致的GLU释放，由此推断咪达唑仑可能是通过抑制GLU释放而发挥其保护细胞的作用。与本试验结果相符，咪达唑仑使小型猪5个脑区内GLU含量下降，提示咪达唑仑的麻醉作用与抑制兴奋性突触的传递，减少GLU的合成和释放有关。

作为兴奋性氨基酸类神经递质，ASP作用效果不及GLU强烈。本试验注射咪达唑仑后，小型猪大脑和海马内ASP含量在诱导期升至最大值；恢复期含量接近于正常水平，与周颖等[7]报道的丙泊酚使大鼠丘脑内ASP含量降低一致；大脑和海马内ASP含量升高相相反。这可能与动物种属相关。提示咪达唑仑能减少丘脑、小脑和脑干内ASP合成与释放，从而减少兴奋性神经递质与其受体的结合，降低神经元兴奋性。

GABA是中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质，夏梦等[8]认为，苯二氮卓类药物可以与GABAA受体相应位点结合，促进GABA与低亲和力的GABA位点进行结合来增加C1-内流。一方面能够使大脑、海马、小脑和脑干GABA合成和释放增加，另一方面亦作用于这些脑区中的GABAA受体，使GABA与GABAA受体的作用加强，降低神经元兴奋性。本试验结果可推测咪达唑仑能够促进大脑、海马、小脑和脑干内GABA的释放，从而增强抑制性突触的传递，降低神经元兴奋性，产生麻醉作用。

GLY受体在脊髓和脑干的抑制性突触传递中起重要作用，而且该受体广泛分布于中枢神经系统中[9]。陈飒飒等[10]通过研究氯胺酮麻醉对大鼠脑内氨基酸类神经递质的影响，认为大鼠海马内GLY含量的增加是氯胺酮麻醉行为学改变的机制之一。本试验显示咪达唑仑能增加五个脑区GLY释放，使得抑制性电位增强，神经元兴奋性降低。

4 结论

咪达唑仑麻醉后，小型猪脑干兴奋性神经递质含量下降37%，大脑和小脑抑制性神经递质含量分别升高65%和33%，咪达唑仑的麻醉机制可能与抑制脑干内兴奋性神经递质释放和促进大脑和小脑内抑制性神经递质释放相关。

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[5] Kubo Y，Sekiya H，Namiki S，et tal. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2010,107(14):6526.

[6] 王恒林，王卓强，刘秀珍，等．咪达唑仑对N-甲基-D-天冬氨酸致伤PC12细胞氨基酸水平的影响[J]．解放军医学杂志，2008,33(1):75-76．

[7] 周颖，康金录，王明远，等．丙泊酚对大鼠不同脑区氨基酸类递质的影响[J]．中华麻醉学杂志，2009,25(4):329-331．

[8] 夏梦，于布为．作用于GABA-R的静脉麻醉药(异丙酚与咪唑安定)之间相互作用的研究进展[J]．国外医学麻醉学与复苏分册，2003,24(4):231-234．

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[10] 陈飒飒，段世明，王钧．氯胺酮麻醉期间大鼠脑内氨基酸递质水平的变化[J]．中国药理学通报，2002,18(1):117-118．

Effects of midazolam on amino acid neurotransmitter in different encephalic regions of miniature pigs

GUO Cen ， LI Xin-ran ， LI Xiao-lei ， LI Ya-nan ， LI Li-na ，WANG Yu-xin ， ZHANG Yi-ming ， WANG Hao ， GAO Li

(College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China)

In this study，we investigated the effects of midazolam on amino acid neurotransmitter in different encephalic regions of miniature pigs ,and the anesthetic mechanism of midazolam on the central nervous system. 20 miniature pigs were divided randomly into 4 groups:control group，inducing group maintenance of anesthesia group，and recovery-from-anesthesia group,and In different anesthetic periods, the content of amino acid neurotransmitters in different encephalic regions of miniature pigs was detected by high performance liquid chromatography (HPLC).The results indicate that the anesthetic mechanism of midazolam may be related with the inhibition excitatory neurotransmitter release of brain stem and promote inhibitory neurotransmitter release of brain and cerebellum.

Midazolam ； Pigs ； Amino acid neurotransmitter ； Anesthesia

GAO Li

2016-07-27

国家自然科学基金面上项目(31372491，31572580)

郭岑(1992- )，女，硕士生，从事临床兽医学研究，E-mail：554892820@qq.com

高利， E-mail：gaoli43450@163.com

S857.144

A

0529-6005(2017)05-0034-03