周佩娇 ， 邢 利 ， 贾伟新 ， 廖 明

(1.华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部人畜共患病重点实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室 ， 广东广州510640 ；2. 广州市南沙区动物防疫监督所 ， 广东广州511458)

1株野禽源H5N6亚型禽流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析

周佩娇1,2， 邢 利1， 贾伟新1， 廖 明1

(1.华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部人畜共患病重点实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室 ， 广东广州510640 ；2. 广州市南沙区动物防疫监督所 ， 广东广州511458)

为了解野生鸟类禽流感病毒的流行情况，对2015-2016年广州地区野生鸟类进行流感监测，分离得到1株H5N6流感病毒。对病毒分离株进行基因克隆、测序和序列分析，结果显示，HA基因属于Clade2.3.4.4，HA蛋白的裂解位点处具有多个连续碱性氨基酸，具备高致病性禽流感病毒的典型分子特征。各基因片段分别与H5N6亚型的猫和家禽等的不同宿主病毒株相应片段具有较高相似性，揭示了野鸟作为流感病毒孵化器的可能性，提示需加强对野生鸟类禽流感监控。

野生鸟类 ； 禽流感病毒 ； 基因克隆 ； 进化分析

禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征。高致病性AIV被世界动物卫生组织(OIE)定为A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。高致病性禽流感临床主要表现为高发病率、高死亡率、产蛋量急剧下降等，同时可引起人感染发病，甚至死亡，对养禽业和人类健康构成严重威胁。近年来，野生鸟类发生禽流感的事例不断增多。2016年8月美国阿拉斯加州国家野生动物保护区的野生绿头鸭确诊出现H5N2亚型高致病性禽流感。2016年10月28日韩国在天安市所在的凤冈川采集的野生鸟类粪便中检测出H5N6型高致病性禽流感病毒。2016年11月2日，阿尔及利亚中南部的盖尔达耶省一自然公园内发生1起野禽H7N1亚型高致病性禽流感疫情。2016年10月以来，德国、法国等欧洲多个国家暴发了H5N8亚型高致病性禽流感疫情并迅速传播到亚洲和大洋洲，感染的禽类包括野生鸟类和家禽，流行病学调查发现，部分国家的家禽疫情可能是由野禽传播病毒引起的，据统计，野禽疫情约占全部疫情的四分之三[1]。我国首次出现野生鸟类感染禽流感的报道是2005年5月发生在青海省刚察县泉吉乡年乃索麻村的青海湖国家级自然保护区斑头雁非正常死亡，由国家农业疫病防治部门确诊为H5N1亚型禽流感病毒，造成死亡候鸟6 000多只[2]。2015年1月15日，黄河湿地三门峡库区陆续出现大天鹅、红头潜鸭、野鸭等野鸟死亡，经确诊为H5N1亚型高致病性禽流感疫情。2016年研究人员在西藏、青海地区的野鸟中也分离到了H7N2禽流感病毒[3]。野生鸟类是禽流感病毒的天然宿主，未实施计划免疫，特别是具有长距离、大范围的迁徙特性，不同来源背景的禽流感病毒在迁徙栖息地与聚集地交汇，容易引发禽流感疫情，造成野生鸟类的发病和死亡，同时还可能将自身携带的禽流感病毒传染给家禽，造成家禽的发病和死亡，甚至传染给人类，引发公共卫生安全事件。对野生鸟类进行禽流感监测，研究其发生发展规律，已经变得十分紧迫。

本研究对2015-2016年广州南部地区采集的野生鸟类粪便或咽肛拭子，进行病毒分离鉴定，得到1株H5N6亚型禽流感病毒，并进行基因克隆、测序和遗传序列分析，研究基因内部位点变化，为禽流感的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 总RNA抽提试剂盒，购自上海飞捷生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自Magen公司；反转录酶及其Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂、ExTaq聚合酶及其Buffer、DL-1 000 Marker、DL-2 000 Marker，购自TaKaRa公司；随机引物、反转录引物、PCR扩增引物，购自广州艾基生物有限公司。

1.2 样品采集 采集2015年10月至2016年10月广州南部地区野鸟样品186份，采集的样品包括粪便、咽及泄殖腔拭子。主要是采集在滩涂或树叶、灌木上野生鸟类的粪便，同时对救护的野生鸟类采集咽拭子和泄殖腔拭子。将采集到的样品装入含有PBS缓冲液的采样管中，低温运输，-20 ℃保存备用。

1.3 病毒分离 将装有样品的采样管震荡后，10 000 r/min离心3 min，取上清液接种3枚9～11日龄SPF鸡胚。每隔12 h照胚，弃去24 h内死亡的鸡胚，收集48 h后的胚胎尿囊液，进行血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)，判断尿囊液是否存在病毒并进行收集，进行RT-PCR检测。

1.4 病毒RNA的抽提及反转录 将采集到的拭子样品充分混匀，10 000 r/min离心3 min，取上清液进行RNA提取。RNA的提取按照上海飞捷生物技术有限公司提取的总RNA极速抽提试剂盒说明书操作。

1.5 基因克隆及测序 利用各基因特异性引物进行PCR扩增，扩增产物按照Megen试剂盒说明书进行目的核酸的纯化与回收，纯化产物克隆到pMD18-T载体上,阳性克隆送广州艾基生物技术有限公司进行测序。

1.6 遗传序列分析 将基因测序结果用EditSeq软件进行序列拼接，得到完整的基因片段。用NCBI Blast进行序列比对，用MEGA6.06软件进行进化树分析。

1.7 关键位点分析 利用MEGA6.06软件进行氨基酸序列突变位点分析。用NetNGlyc 1.0 Server分析序列糖基化位点。

2 结果

2.1 病毒分离结果 2015年10月至2016年10月共采集广州南部地区野鸟样品186份，其中粪便182份，咽、泄殖腔拭子4份。对样品进行病毒培养后，共分离到1株H5N6亚型禽流感病毒，命名为A/Wildfowl/Guangdong/GZ882/2015(H5N6)(简称15 882株)。

2.2 相似性分析 将15882分离株进行全基因组测序，基因序列经NCBI BLAST 分析，结果显示，HA基因开放阅读框长度为1 704 bp，与2015年广东分离到的猫流感毒株 A/feline/Guangdong/1/2015(H5N6)相似性达99%；NA基因开放阅读长度为1 380 bp，与2015年湖北分离到的鸭流感毒株A/duck/Hubei/XG18/2015(H5N6) 相似性达99%；M基因开放阅读框长度759 bp，与2013年深圳分离到的鸡流感毒株A/chicken/Shenzhen/1061/2013(H5N6) 相似性达99%；NS基因开放阅读框长度为675 bp，与2015年广东分离到的毛腿沙鸡的流感病毒株A/Syrrhaptes paradoxus/Guangdong/ZH283/2015(H5N6)相似性达99%；PA基因开放阅读框长度为2 151 bp，与2015年武汉分离到的斑鸠流感毒株A/turtledove/Wuhan/HKBJ27/2015(H5N6)相似性达99%；PB1基因开放阅读框长度为2 274 bp，与2015年广东流感分离株A/environment/Guangdong/GZ670/2015(H5N6)相似性达99%；PB2基因开放阅读框长度为2 280 bp，与2014年的越南分离到的鸭流感病毒株A/duck/Vietnam/LBM760/2014(H5N6)相似性达99%；NP基因开放阅读框长度为1 497 bp，与2015年A/environment/Guangdong/GZ693/2015(H5N6)相似性达99%。

2.3 遗传序列分析 15882分离株的HA、NA基因核酸序列进化分析结果表明， HA基因属于Clade2.3.4.4(图1)，NA基因属于欧亚分支(图2)。

图1 HA基因进化树分析

2.4 氨基酸序列分析与关键位点分析 HA氨基酸序列分析结果表明，HA基因编码567个氨基酸，具有7个潜在糖基化位点(表1)。HA蛋白的裂解位点处具有多个连续碱性氨基酸PLRERRRKRGLF，符合高致病性禽流感病毒典型分子特征。HA受体结合位点存在S137A、K193N突变。NA蛋白相应位点没有改变。PB2蛋白的E627K和D701E位点都没有发生改变。

图2 NA基因进化树分析

表1 HA相关位点分析

3 讨论

根据基因序列遗传进化分析结果，本研究中的H5N6亚型禽流感分离株属于近年流行的Clade2.3.4.4，与哺乳动物猫的流感病毒基因片段高度相似。NA基因、PB2基因、M基因与家禽流感病毒相应片段高度相似，NS基因、PA基因与野鸟流感病毒基因片段高度同源，这说明本研究中的15882分离株可能包含了哺乳动物、家禽和野鸟不同宿主来源的基因片段，不同宿主来源的流感病毒基因片段在野鸟体内进行组合包装，随着这种重组频率的提升，不断交流变异出具有高致病性和传播性病毒的可能性也大大增强。

连接在天冬酰胺(Asn,N)的蛋白糖基化是一种广泛存在于生物体内的共价修饰方式。病毒通过赋予其表面糖蛋白与宿主相同的糖链结构特征，可以逃避宿主免疫系统的监视。根据氨基酸序列分析结果，本研究中的HA蛋白具有7个潜在的糖基化位点，有助于病毒更加轻松的躲避机体的免疫攻击。流感病毒主要通过HA蛋白识别宿主细胞唾液酸(SA) 受体而感染宿主，禽类和人类分别表达SA α-2、3 半乳糖受体和SA α-2、6半乳糖受体为主。HA受体结合位点的结构决定着病毒结合哪种唾液酸受体，从而影响感染宿主的范围，改变受体结合特异性可能会导致宿主范围的改变和病毒的传播[4]。本研究中HA蛋白受体结合位点发生S137A、K193N突变，增加了对人的SAа-2，6半乳糖受体的辨识度，从而增强其对人的感染的可能性[5]。在HA 的第222～224 位存在保守氨基酸序列QRG，表明禽样受体结合位点没有实质性的改变[6]。

我国在2012年以前，禽流感流行株以H5N1亚型禽流感为主，自2014年开始转变为以H5N6亚型禽流感病毒为主[7]。本研究在广州南部野生鸟类中也分离到该亚型病毒株，可见H5N6亚型流感病毒扩散之广，需要我们提高警惕，加强防控。广州地处伶仃洋之滨、珠江出海口，拥有大片红树林、滩涂和海岸线，形成了良好的鸟类、红树林及湿地生态系统。湿地内的土壤主要由海湾沉积物形成，由于良好的生态环境和地理位置，各种鱼虾、水草也在这片滩涂里自然生长，为过冬的候鸟提供了安全的栖息地和丰富的食物，是野生鸟类的重要的迁徙中转地和栖息地，被喻为“候鸟天堂”[8]。2010年以来，发现的鸟类就有149种，其中冬候鸟或旅鸟77种，留鸟63种，夏候鸟9种，物种多样性和科属多样性较为丰富，主要有黑翅长脚鹬，苍鹭、斑嘴鸭、白琵鹭等[9]。在历时近一年的采样监测中，发现秋冬季野生鸟类较多，样品密集度大，采集较易，夏季鸟类减少，采样时间花费较多，这主要跟秋冬季候鸟南迁入广州有关。世界上8条候鸟迁徙路线，有3条经过我国，其中西太平洋线，主要是从阿拉斯加等到西太平洋群岛，经过我国东部沿海省份。其中广州南部红树林湿地片区是候鸟重要的迁徙中转地和栖息地，随着近年来当地政府生态环境建设和保护力度的加强，停留鸟类种类和数量普遍增多，因此，对湿地候鸟的禽流感监测十分迫切，相应的研究需要积极开展。

4 结论

本研究从野生鸟类样品中分离到1株H5N6亚型禽流感病毒株,属于近年流行的Clade2.3.4.4，各基因片段分别与哺乳动物、野禽和家禽相应片段相似度较高。同时，该分离株的氨基酸序列分析结果显示，病毒株具有高致病性禽流感病毒典型分子特征，HA存在7个潜在糖基化位点，受体结合位点也发生了改变。建议加强对野生鸟类的流感监控，将其纳入到禽流感防控的常规监测中，建立长效防控机制。

[1] 蒋文明，宋建德，黄保续.近期全球H5N8亚型禽流感疫情分析[J].中国动物检疫，2017,34(1):1-7.

[2] 郑杰，何玉邦.对青海湖区野生鸟类禽流感疫情防控的思考[J].青海科技，2006，1：8-9.

[3] Su, ShuoXing, GangWang,Junhua Li，etal. Characterization of H7N2 Avian Influenza Virus in Wild Birds and Pikas in Qinghai-Tibet Plateau Area [J]. Scientific Reports，2016,6(30974).

[4] Hongbo Guo1,Erik de Vries1,Ryan McBride,etal.Highly Pathogenic Influenza A(H5Nx) Viruses with Altered H5 Receptor-Binding Specificity[J].Emerging infectious diseases，2017,23(2)：220.

[5] Yang Z Y,Wei C J,Kong W P,etal.Immunization by avian H5 influenza hemagglutinin mutants with altered receptor binding specificity[J].Science,2007,317(5839): 825-828．

[6] Gambaryan A S,Tuzikov A B,Bovin N V,etal.Differences between influenza virus receptors on target cells of duck and chicken and receptor specificity of the 1997 H5N1 chicken and human influenza viruses from Hong Kong[J].Avian Dis,2003,47(3): 1154-1160．

[7] 蒋文明，陈继明. 我国高致病性禽流感的流行与防控 [J].中国动物检疫，2015，32(6)：5-9.

[8] 常宏，廖宝文，粟娟，等.广州南沙红树林湿地鸟类群落多样性(2005—2010)[J].应用与环境生物学报，2012，18(1):30-34.

[9] 常弘，廖宝文.广州市南沙湿地公园的鸟类多样性与禽流感监控[J].湿地科学与管理，2009，5(1):64-65.

Isolation, identification and phylogenetic analysis of one H5N6 avian influenza virus from wide birds

ZHOU Pei-jiao1, 2, XING Li1, JIA Wei-xin1， LIAO Ming1

(1.College of Veterinary Medicine, South of China Agricultural University, National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Key Laboratory of Zoonoses, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Animal Vaccine Development,Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Zoonoses Control and Prevention of Guangdong,Guangzhou 510640, China; 2.Servicing department of pasturage, Nansha, Guangzhou 511458, China)

In order to study the epidemiology of avian influenza in wild birds, one H5N6 subtype of avian influenza virus was isolated from wild birds in Guangzhou during influenza virus surveillance from 2015 to 2016. The gene segments were cloned, sequenced and analyzed. The results showed that the HA gene of the isolate belonged to clade 2.3.4.4 lineage and contained multiple basic amino acids at the cleavage site , which was characteristic of highly pathogenic AIV. The other gene segments of the strain had high homology with the strains of feline and poultry, implicating that the wild birds were the possible incubator of influenza virus.Our findings suggest that the influenza virus surveillance in wild birds should be strengthened.

Wild birds ; Avian influenza virus ; Gene clone ; Phylogenetic analysis

LIAO Ming

2017-02-20

科技基础性工作专项(2012FY111000)；现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-42-G09)；农业部动物疫情监测与防治项目[农医发(2016)11号]；东莞市科技计划项目(2014108101041)

周佩娇(1981-)，女，兽医师，硕士，从事禽流感防控工作，E-mail：52856393@qq.com

廖明，E-mail：mliao@scau.edu.cn

S852.65+9.5

A

0529-6005(2017)05-0003-04