诸葛飞 童华 高玲娟 王一荃 王祝鸣

COX-2基因在紫杉醇/卡铂致卵巢癌细胞凋亡中的作用及机制研究

诸葛飞 童华 高玲娟 王一荃 王祝鸣

目的 探讨环氧合酶-2(COX-2)在紫杉醇/卡铂致卵巢癌细胞凋亡中的作用及机制。 方法 以卵巢癌CAOV-3细胞系,卵巢癌组织及其相应的癌旁正常组织为材料,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测COX-2基因mRNA和蛋白质表达;流式细胞术检测CAOV-3细胞的凋亡情况，同时采用透射电镜观察细胞的超微结构变化。 结果 COX-2基因在卵巢癌组织中的表达明显高于其对应的癌旁正常组织(P<0.01);与紫杉醇/卡铂组比较,转染紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2组卵巢癌细胞凋亡率明显减少(P<0.01),且细胞超微结构未发生显著改变。 结论 COX-2基因在紫杉醇/卡铂治疗卵巢癌中发挥重要作用,其有望成为卵巢癌治疗的分子新靶标。

卵巢癌; 紫杉醇/卡铂; COX-2

卵巢癌是严重威胁女性生殖系统健康的常见恶性肿瘤,来源于卵巢生发上皮的恶性肿瘤占卵巢恶性肿瘤的85%～90%[1]。卵巢上皮癌主要发生在老年女性,且5年生存率较低, 卵巢癌复发病人的生存期仅为1～2年[2]。目前卵巢癌治疗的一线化学药物主要是紫杉醇/卡铂,化疗药物的耐药性依然是个难题。研究显示,环氧合酶-2(COX-2)在卵巢上皮癌细胞的发生、发展过程中发挥着重要的作用[3],本实验将紫杉醇和卡铂联合作用于CAOV-3细胞,观察其在致卵巢癌细胞凋亡的过程中,COX-2基因所起的功能及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2007年1月至2012年12月间在南京市妇幼保健院行卵巢癌手术的病人标本30例,诊断明确。每个标本的癌组织及癌旁组织配对,标本取下后立即储藏在-80 ℃的液氮中备用。按年龄是否≥60岁分为老年组和非老年组。其中老年组7例,年龄60～68岁,平均(65.8±3.9),非老年组23例,年龄35～59岁,平均(44.3±7.7)岁。

1.2 细胞培养 卵巢癌细胞株CAOV-3购自中国典型物种保藏中心。细胞在RPMI 1640 培养基中(包含10%胎牛血清、100 U/ml庆大霉素、100 μg/ml链霉素、10%非必需氨基酸)进行培养。卵巢癌细胞培养及实验在37 ℃,5% CO2的培养箱(Heraeus,德国)中进行。

1.3 CAOV-3卵巢癌细胞分组 以pCMV-COX-2质粒、pCMV空载质粒分别转染CAOV-3卵巢癌细胞,取对数生长期的各组细胞,施加含卡铂40 μg/ml和紫杉醇4 nmol/L的100 ml RPMI 1640 培养基,将卵巢癌细胞分别分组为:紫杉醇/卡铂组,紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2质粒组和紫杉醇/卡铂+pCMV质粒组,继续培养72 h,观察卵巢癌细胞的系列检测指标。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR) 取卵巢癌及其相应的癌旁正常组织研磨成粉末,将粉末迅速转移至EP管中,6000 r/min,离心15 min,弃上清。每50～100 mg组织,加入1 ml Trizol,移液器反复吹打裂解组织。反应体系配置如下:20 μl反应体系包含SYBR Green染料 10 μl,Taq聚合酶 2 μl,dNTPs 1 μl,上、下游引物 1 μl,样品cDNA 5 μl。ABI Prime 7300定量PCR检测仪(Biosystems),运行参数为50 ℃/2 min,95 ℃/5 min,95 ℃/20 s,60 ℃/2 min,35个循环,单点荧光在60 ℃进行检测。

1.5 免疫印迹 收取CAOV-3卵巢癌细胞,以每107个细胞加入1 ml细胞裂解液比例,加入细胞裂解液后,200 μl移液器反复吹打,至蛋白析出。取100 μg总蛋白上样,电泳后,电转移至PVDF膜,加入5 %脱脂奶粉稀释的一抗,摇床上,37 ℃,4 h,以TBST充分洗涤,加入HRP结合的二抗,37 ℃,1 h,加入显色液,避光反应5～10 min后,暗室中,曝光;以Bio-Rad凝胶成像分析仪,对印迹条带进行灰度扫描,用以下公式进行计算:目的蛋白/内参蛋白。

1.6 流式细胞仪 将细胞数调整为(1～5)×106/ml,1200 r/min,10 min,弃上清。4 ℃,PBS洗涤卵巢癌细胞,用结合缓冲液250 μl重新悬浮细胞。取100 μl的细胞悬液,加入5 μl Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)和10 μl 的碘化丙啶(PI)溶液,避光孵育30 min。加入结合缓冲液400 μl,于1 h内流式细胞仪进行分析检测。流式细胞仪激发光波长用488 nm,用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长>560 nm的滤器检测PI。

1.7 透射电镜 将培养的卵巢癌细胞株CAOV-3,采用胰酶消化后制成悬液于离心管内,以2000 r/min,离心15 min,使卵巢癌细胞压缩成团(以1-1.5 mm大小为宜),以2.5 %戊二醛及1 %锇酸进行双固定,15 min后,Epon 812进行包埋处理,超薄切片,在JEM-1010透射电镜下,观察细胞的超微结构。

2 结果

2.1 COX-2基因在卵巢癌和癌旁正常组织中的表达 RF-PCR结果显示,卵巢癌组织中COX-2 mRNA的表达显著高于其相应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P<0.01)。老年组COX-2 mRNA在卵巢癌组织中的表达亦显著高于非老年组(P<0.05)。见表1。

表1 COX-2 mRNA在卵巢癌组织及癌旁组织中的表达

注:与癌旁正常组织比较,**P<0.01;与非老年组比较,△P<0.05

2.2 紫杉醇/卡铂作用下COX-2蛋白的表达 紫杉醇/卡铂作用于体外培养的卵巢癌CAOV-3细胞株,分别于24 h,48 h,72 h后,采用免疫印迹检测COX-2蛋白的表达,结果显示,紫杉醇/卡铂作用下,COX-2蛋白的表达量逐渐减少,呈现出显著的时间依赖性。

注：与0 h比较，**P<0.01,***P<0.001图1 COX-2 蛋白的表达

2.3 卵巢癌CAOV-3细胞株凋亡检测 利用流式细胞技术,评估不同质粒转染卵巢癌CAOV-3细胞株,紫杉醇/卡铂对细胞凋亡的影响。CAOV-3细胞凋亡百分比为Q1-UR(右上象限数值)与Q1-LR(右下象限数值)之和,数据表明,与紫杉醇/卡铂组比较,紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2质粒组CAOV-3细胞凋亡数量显著减少,2组比较差异具有统计学意义(P<0.01);而紫杉醇/卡铂+pCMV质粒组与紫杉醇/卡铂组比较,差异无统计学意义(P> 0.05),见图2。

2.4 卵巢癌CAOV-3细胞株凋亡形态 透射电镜下观察卵巢癌细胞的超微结构,紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2质粒组,卵巢癌细胞形态基本正常;而紫杉醇/卡铂组与紫杉醇/卡铂+pCMV质粒组显示,细胞形态出现显著改变:细胞核边缘化,细胞质体积相对增大,核凝缩并发生断裂,细胞表面微绒毛明显减少,细胞核内染色质聚集且边缘化,呈现大量空泡,细胞器部分变性,凋亡小体形成，见图3。

3 讨论

卵巢癌病人化学药物治疗的失败,与肿瘤细胞的药物耐药性密切相关。卵巢癌的一线化疗药物紫杉醇/卡铂的耐药机制尚在研究中。紫杉醇和卡铂诱导细胞凋亡的机制不同,根据药物作用机制,卡铂属于细胞非周期性的化疗药:铂-细胞DNA交联形成络合物,影响细胞DNA复制;紫杉醇属于细胞周期特异性化疗药物,其分子通过与细胞内各种微管蛋白的结合,影响细胞有丝分裂过程。因此,能抑制细胞凋亡的因素,也诱导了肿瘤细胞的药物耐药性。越来越多的实验显示,COX-2有促进肿瘤细胞增殖活性的作用,其抑制细胞凋亡的作用日益受到重视。

注:与紫杉醇/卡铂组比较,**P<0.01;1：紫杉醇/卡铂组;2:紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2质粒组; 3:紫杉醇/卡铂+pCMV质粒组。图2 CAOV-3细胞的凋亡检测

1:紫杉醇/卡铂组;2:紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2质粒组; 3:紫杉醇/卡铂+pCMV质粒组图3 CAOV-3细胞的超微结构 (×5000)

COX-2是前列腺素合成中的限速酶,在子宫内膜癌及卵巢上皮癌中均有表达[4],其基因位于1号染色体q25.5-25.3,COX-2是一种诱导型酶,在正常生理状态下不容易检测出[5]。COX-2在病理状态下,是如何被激发过度表达,通过何种途径影响细胞对化疗药物的耐药机制尚不清楚。结合COX-2属于膜蛋白的特性,有报道,COX-2通过多种信号通路增加癌细胞的活性和侵袭性,如:PI3-k/Akt[6],E-钙粘连蛋白等[7]。有研究显示,COX-2的过度表达可以抵抗吉西他滨对乳腺癌细胞231/GEM的化疗作用[8],可以抑制紫杉醇对胃癌细胞株BGC-823的凋亡[9]。本文数据显示,卵巢癌组织中的COX-2基因的表达高于癌旁组织,紫杉醇/卡铂诱导CAOV-3细胞凋亡的同时,COX-2蛋白含量减少也呈药物作用时间依赖性;当COX-2基因过度表达时,紫杉醇/卡铂+pCMV-COX-2组的细胞凋亡数量明显少于其他2组,细胞凋亡形态也变化不大,而其他2组(紫杉醇/卡铂组和紫杉醇/卡铂-pCMV质粒组)的细胞呈凋亡改变。可见,紫杉醇/卡铂可以减少COX-2基因的表达;而过度表达的COX-2基因,可逆转由卡铂和紫杉醇诱导的CAOV-3细胞凋亡。据此推测,在紫杉醇/卡铂治疗卵巢癌发生耐药时,COX-2基因也起了重要作用。本文实验提示,老年卵巢癌病人的COX-2基因含量高于非老年病人,提示老年癌病人的化疗效果欠佳可能与此有关。

如何降低COX-2基因的过度表达,也是目前研究的热点。实验显示,塞来昔布(COX-2选择性抑制剂)对顺铂作用的卵巢癌细胞SKOV-3有增敏作用[10];对接受顺铂治疗的移植卵巢癌细胞的小鼠,美洛昔康(COX-2选择性抑制剂)有抑制其卵巢癌组织增殖的作用[11]。因药物的心血管不良反应,COX-2的作用机制还在研究中。降低COX-2基因的表达,可以减少卵巢上皮癌复发、耐药的机会,为临床指出新的治疗方向,COX-2基因有望成为卵巢上皮癌治疗的分子新靶标。

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Role of cyclooxygenase-2 gene in the apoptosis of ovarian cancer cell induced by paclitaxel/carboplatin

ZHUGEFei.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,NanjingBenqMedicalCenterAffliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210019,China;TONGHua,GAOLing-juan.ObstetricsandGynecologyHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210004,China;WANGYi-quan.LongHuaHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai20032,China;WANGZhu-ming.KeyLaboratoryofAntibodyTechnology,MinistryofHealth,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the role of cyclooxygenase-2 (COX-2) in the apoptosis of ovarian cancer cells induced by paclitaxel/carboplatin. Methods In ovarian cancer cell line CAOV-3, ovarian cancer tissue, and the corresponding adjacent normal tissue, the expression of COX-2 mRNA gene and protein was explored by Real-time PCR and Western blot, meanwhile, CAOV-3 apoptosis was detected by flow cytometry. Its ultra-microstructure changes were observed by transmission electron microscope. Results The expression of COX-2 mRNA gene was significantly higher in ovarian cancer tissue than that in adjacent normal tissue (P< 0.01). Compared with paclitaxel/carboplatin group, the apoptosis rate of ovarian cancer cells was obviously reduced(P< 0.01). And the morphological changes of apoptosis were not significant in paclitaxel/carboplatin+pCMV-COX-2 group. Conclusions Cox-2 plays an important role in ovarian cancer cell apoptosis induced by paclitaxel/carboplatin, and may be a new therapy molecular target.

ovarian cancer; paclitaxel/carboplatin; cyclooxygenase-2

南京市科技发展项目(201402023)

210019江苏省南京市，南京医科大学附属南京明基医院妇产科(诸葛飞)；210004江苏省南京市，南京医科大学附属妇产医院(童华，高玲娟)；200032上海市，上海中医药大学附属龙华医院(王一荃)；210029江苏省南京市，南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室(王祝鸣)

童华，Email：thua8@163.com

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.06.006

2017-02-14)