王之涵,任力,赵亮

(1.上海同济大学医学院,上海 200092;2.复旦大学附属上海市浦东医院神经外科,上海 201300)

人重组烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶2的表达、纯化及酶活力测定

王之涵1,任力2,赵亮2

(1.上海同济大学医学院,上海 200092;2.复旦大学附属上海市浦东医院神经外科,上海 201300)

目的：通过大肠杆菌体系诱导表达烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶2(NMNAT2)，并测定纯化的重组NMNAT2酶蛋白催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的酶比活力。方法：在大肠杆菌BL21(DE3)体系优化条件下诱导表达NMNAT2重组蛋白，利用Ni-NTA Superflow Kit进行目的蛋白的纯化，Western blot法进行鉴定，并通过酶联荧光法测定其催化产物NAD，测定其酶活性。结果：人重组质粒NMNAT2-pET-24a可以在大肠杆菌BL21(DE3)体系中诱导表达。诱导条件为：LB培养液(卡那霉素，15 μg/mL)中37 ℃，IPTG(1.0 mM)诱导表达4 h。纯化获得的NMNAT2重组蛋白具有较高的酶活性。结论：NMNAT2-pET-24a可在大肠杆菌BL21(DE3)体系中稳定表达，优化条件下可获得较高活性的纯化NMNAT2重组蛋白，可用于神经保护功能及酶蛋白的活性调控研究。

烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶-2; 纯化; 酶活力; 轴突退变; 神经保护

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinate adenine dinucleotide，NAD)是哺乳动物细胞中的一个重要分子，在生物体内的生命活动中起着至关重要的作用，不仅是生物体内200多种氧化还原酶的辅酶，还是细胞内信号通路的一个重要组成部分[1]。作为NAD的合成酶，烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)广泛存在于哺乳动物细胞中。在补救途径中，其可直接催化烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMA)而生成NAD。人和小鼠的NMNAT家族有3个成员，即NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3，均具有保护神经元完整性，维持脑、神经系统功能正常运转的功能[2]。在哺乳动物中，NMNAT1～3具有不同的亚细胞定位，NMNAT1定位于细胞核中，NMNAT2存在于高尔基体，NMNAT3存在于线粒体中[3-5]。研究[6]发现，神经退行性疾病、神经元功能退变及轴突功能减弱或丧失均与NMNAT基因失功能性突变或蛋白表达量较少有关。然而，细胞或体内实验研究[7]证实，NMNATs蛋白过度表达具有神经保护，对抗因环境、药物等因素所致的神经元活性降低、损伤和老化等神经功能障碍和退变的作用，可在一定程度上维持神经系统细胞和组织的生理功能。

轴突功能退变是广泛存生于生物发育和疾病病变过程中的一种轴突自我清除现象。近年来的研究[8]已证实，延缓轴突退变可以缓解或者推迟某些神经退行性相关疾病模型动物的发病症状和发病进程。NMNAT家族中NMNAT2特异性地存在于高尔基体中，参与对应的生物功能。与NMNAT1和NMNAT3比较，NMNAT2在大脑中高度表达。Yan等[9]发现，在APPswe/PS1dE9转基因小鼠中，NMNAT2与阿尔茨海默症密切相关。Feng等[10]认为，在斑马鱼模型中，NMNAT2在Mauthner-细胞中的过度表达能有效延迟神经退行性病变。此外，破坏NMNAT2的NAD合成活性可明显抑制轴突的保护功能。可见，NMNAT2在神经退行性疾病中具有极其重要的功能[11-12]；调节具有神经保护功能的NMNAT2酶蛋白活性，可用于人类脑神经疾病的治疗[13-14]。本研究利用人重组质粒NMNAT2-pET-24a在BL21(DE3)大肠杆菌体系诱导表达NMNAT2蛋白，并鉴定和测定了纯化的重组NMNAT2酶蛋白催化NAD生物合成的酶比活力，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人重组质粒NMNAT2-pET-24a(50 ng/μL)购自上海近岸生物科技有限公司；BL21(DE3)感受态细胞购自北京博大泰克生物基因技术责任有限公司；LB Broth培养液、LB Agar、LB粉末、卡那霉素、异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside，IPTG)均购自日本宝生物工程株式会社；BugBuster Master Mix蛋白裂解液购自Novagen公司；Halt Protease Inhibitor Cocktail购自Thermo公司；Ni-NTA Superflow Kit购自凯杰(苏州)转化医学研究有限公司；0.25～2.0 μg/μL牛血清白蛋白标准溶液、BCA Protein Assay Kit购自Thermo公司；酶标板购自Corning公司；LDS sample buffer(4X)、Sample reducing agent(10X)、NuPAGE 4%～12% Bis-Tris(1.0 mm，12 well)预制胶、MOPS running buffer(20X)、预染蛋白质分子量标准品、Gel transfer stocks(NC膜)均购自Life Technologies公司；5%脱脂奶粉自配；Anti-NMNAT2抗体一抗、NAD/NADH Assay Kit购自Abcam公司；IRDye 800CW羊抗鼠二抗购自LI-COR公司；β-烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)50 mM，10×Reaction Buffer：500 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM MgCl2和2 M NaCl，5×Stop Buffer：200 mM EDT，pH 8.0；ATP(100 mM)购自Sigma-Aldrich公司。

细菌培养箱、水浴锅、细菌培养摇床、超声破碎仪、平板振荡器、侧板摇床、超净台、pH计等购自上海精宏仪器仪表公司；MilliQ纯水仪购自Millipore公司；低温高速离心机、分光光度计购自德国Eppendorf公司；蛋白电泳槽、电泳仪、转膜装置iBlotTM购自Life Technologies公司；Odyssey红外激光成像系统购自LI-COR公司；多功能酶标仪购自BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 人NMNAT2蛋白表达 第1天，取出重组表达质粒NMNAT2-pET-24a(50 ng/μL)，化冻，3 000 rpm离心2 min；取出-80 ℃保存的BL21(DE3)感受态细胞(100 μL/管)，冰上化冻5 min，吸取30 ng质粒与感受态细胞混匀，冰上放置30 min；取出后立即放入水浴锅42 ℃，热激80 s，随后冰上放置5 min；加入热激的感受态细胞到1 mL LB Broth培养液中，37 ℃摇床，200 rpm，培养50 min；3 000 rpm离心3 min，吸弃上清，留100 μL，重悬沉淀；吸取60 μL悬液涂于LB Agar板，放入37 ℃培养箱中，过夜(12～14 h)培养。第2天，从平板中挑取单菌落至对应卡那霉素抗性的LB(3 mL)试管中，37 ℃摇床，200 rpm, 活化培养；约2.5 h，测光密度(optical density，OD)600值至0.4～0.8；转入1.5 mL EP管中，4 ℃保存过夜。第3天，3 000 rpm离心3 min，吸弃上清，重悬细胞沉淀在1 mL新鲜的LB培养液中，转移至100 mL培养液(卡那霉素，15 μg/mL)中，37 ℃摇床培养，200 rpm，约2 h，测OD 600值至0.4～1.0之间，0.6较适宜；加入IPTG储液，终浓度为1.0 mM，37 ℃摇床，200 rpm，诱导表达培养3 h，冰上放置5 min，转至离心管中，4 ℃，5 000 rpm离心5 min；用0.25倍体积的预冷20 mM Tris-HCl，pH 8.0 洗涤细菌2次，收集细菌，-80 ℃保存、备用。

1.2.2 NMNAT2蛋白的纯化 (1)配制BugBuster Master Mix 蛋白裂解液，含蛋白酶抑制剂Halt Protease Inhibitor Cocktail；(2)取出-80 ℃保存的菌体，冰上化冻10 min，加入裂解液，充分重悬，冰浴超声处理3次，每次15 s，间隔1 min；(3)室温放置充分裂解20 min，12 000 rpm离心，4 ℃，20 min，收集细菌沉淀及上清液，蛋白电泳分析；(4)根据His·Tag融合蛋白纯化操作手册说明，上样，柱层析，洗涤，蛋白洗脱等步骤纯化蛋白，收集各组分，行蛋白电泳分析。

1.2.3 BCA法蛋白定量 (1)牛血清白蛋白0.25～2.0 μg/μL作为标准品，稀释待测样品至合适浓度，取一块酶标板，依次加入10 μL样品及标准品；(2)根据样品及标准品数量，按50 倍体积BCA试剂A 加1体积BCA 试剂B(50∶1)，配制适量BCA 工作液，充分混匀；(3)各孔加入 200 μL BCA 工作液，把酶标板放在振荡器上振荡 30 s，37 ℃放置30 min，而后在562 nm下读板测定，记录OD值；(4)以标准品蛋白含量(μg)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据所测样品OD值，依标准曲线即可求得相应样品的蛋白浓度(单位：μg/μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。

1.2.4 蛋白电泳分析 上述蛋白质样本溶液，按3体积蛋白样本加1 体积LDS sample buffer (4X，含Sample Reducing Agent)(4∶1)准备蛋白电泳样品，95 ℃煮沸5 min，备用；准备NuPAGE 4%～12% Bis-Tris预制胶，电泳缓冲液 MOPS running buffer(1X)，预染蛋白质分子量标准，每孔上样量为10 μg 蛋白，纯化后NMNAT2上样1 μg；使用专用枪头，防止样品溢出加样孔；100 V电压，电泳100 min，当染料到达胶的底部，关电源停止电泳。

1.2.5 Western blot 蛋白质鉴定 蛋白质电泳完成后，使用标准转膜装置iBlotTM及NC膜转膜，设定转膜程序为Program 3，转膜7 min；完毕后，将膜放置到去离子水中，漂洗1～2 min，洗去膜上的转膜液；加入blocking buffer(5%脱脂奶粉)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1 h，一抗孵育，按照1∶1 000比例用blocking buffer稀释一抗，4 ℃孵育过夜；吸弃一抗溶液后，加入PBST洗膜5～6 min，共3次；二抗孵育，按照1∶20 000比例用blocking buffer稀释二抗，加入二抗室温孵育45 min，吸弃二抗溶液后，PBST 洗膜5～6 min，共3次；去离子水漂洗膜2次，Odyssey红外激光成像系统扫描，蛋白显色。

1.2.6 重组NMNAT2蛋白酶酶比活力测定 准备纯化的重组蛋白NMNAT2(25 μg/mL)，96孔酶标板，β-NMN 50mM，10×Reaction Buffer：500 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM MgCl2和2 M NaCl，5×Stop Buffer：200 mM EDTA，pH 8.0，NAD/NADH assay Kit和ATP 100 mM。

将各试剂溶液加入至96孔板中，最后加入纯化的NMNAT2蛋白。NMNAT2 催化生成NAD/NADH。室温反应时间为：5 s、10 s、20 s、30 s，1 min、2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min。加入10 μL 5×Stop Buffer终止催化反应，总体积为50 μL。参照NAD/NADH assay Kit步骤，准备标准品和以上反应终产物混合溶液，按50 体积NAD Cycling Buffer Mix加1 体积NAD Cycling Enzyme Mix(50∶1)混匀，得NAD Cycling Mix 溶液，加入至96孔板中，混匀，室温反应5 min，加入NADH显影剂， 室温放置3 h。OD 450 nm读板，记录OD值。根据标准曲线，求得对应NAD/NADH浓度。设定酶催化的标准单位为U/mgP，即1.0 mg酶每分钟催化产生的NAD的量为一个单位，计算表达纯化的NMNAT2 蛋白酶的酶比活力。

2 结果

2.1 人NMNAT2蛋白的诱导表达

将重组质粒NMNAT2-pET-24a转化到适宜的表达宿主菌BL21(DE3)的化学感受态细胞中，LB培养液，37 ℃摇床培养，OD600值至0.6较适宜，1.0 mmol/L IPTG 诱导目的蛋白NMNAT2表达，获得的菌体变性裂解后，NuPAGE电泳可见(图1)。可检测到在相对分子质量约35 kDa处有目的蛋白表达，蛋白成功诱导表达。蛋白裂解后，诱导的蛋白主要以不溶形式存在，少量以溶解形式存在。其溶解组分可应用于后续蛋白的纯化与浓缩。

2.2 人NMNAT2蛋白的纯化

利用Ni-NTA Superflow Kit 亲和层析柱进行目的蛋白NMNAT2 纯化，其结合NMNAT2重组蛋白上6×His标签。电泳结果显示，可溶性组分经过Ni-NTA柱纯化后，可获得纯化的NMNAT2蛋白，主要存在于洗脱液组分2(E2)中(图1)；Western blot结果示，纯化后，NMNAT2蛋白可与NMNAT2抗体发生特异性反应，分子量约34 kDa(图2)。获得的大量含有纯的目的蛋白洗脱液，可行进一步浓缩，供后续蛋白鉴定、酶活力测定及其他蛋白功能研究。

2.3 人NMNAT2蛋白的酶活力测定

本研究应用商业化的NAD/NADH定量试剂盒，利用酶联荧光法检测 NMNAT2重组蛋白酶的活性[15]。其检测原理为：NMN 在 ATP 的存在下，由 NMNAT2催化生成 NAD， NAD 可被乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)转化为 NADH。适时终止反应，测定终止时，单位时间内NMNAT2催化合成NAD的量。标准曲线为y=0.003 5X+0.027 2,R2=0.997 5。

测定两批纯化的NMNAT2时，测定曲线见图3～图4。反应初始阶段 0～2 min，依反应初始速率，获取酶活力曲线斜率(图5)。酶活力曲线为：Sample-A，y=0.017 3X+0.613 3，R2=0.997；Sample-B，y=0.011 5X+0.004 27，R2=0.990 7。X轴为时间参数；Y轴为产生NAD的量。测定时，加入蛋白量为Sample-A，0.012 mg；Sample-B，0.008 mg，所得酶比活力为Sample-A 86 500 U/mgP；Sample-B 86 250 U/mgP，即1.0 mg酶每分钟催化产生的NAD的量分别为86 500 pmol、86 250 pmol。

3 讨论

近年来，随着老年人群的不断增加，如何预防和治疗神经退行性疾病已成为亟待解决的难题。轴突退行性病变是一种在慢性神经退行性疾病情况下出现的一种病理现象，而轴突退变则被视为是一个很好的治疗神经退行性疾病的靶点。NAD在轴突退变发病过程中起重要作用， NMNAT是NAD生物合成的关键酶，对维持体内NAD水平的稳态至关重要[16]。哺乳动物中存在3种NMNAT，即NMNAT1、NMNAT2、NMNAT3。NMNAT1或 NMNAT3的过表达可以减缓轴突退变，但NMNAT2在轴突退变中的作用目前尚未完全阐明。NMNAT2是分子量为34 kDa的二聚体结构，共有307个氨基酸残基，内部含有由3个外显子编码的亚型特异性序列，其性质不稳定，易于氧化，在神经细胞内半衰期<2 h。人NMNAT2在中枢神经组织中含量丰富，特别在大脑中高度表达，其在神经细胞体内的缺失会直接导致轴突生长停滞，继而发生轴突截断，是轴突生长和生存的必要条件[17]。

本研究确定了人工构建的重组质粒NMNAT2-pET-24a在体外大肠杆菌BL21(DE3)体系中37 ℃、IPTG(1.0 mM)诱导表达NMNAT2重组蛋白的条件与方法，建立了应用Ni-NTA Superflow Kit进行目的蛋白的纯化条件，并通过酶联荧光法测定其催化产物NAD的方法来测定酶活性。研究结果表明，适宜的宿主对蛋白的表达具有较重要的作用，通过优化蛋白表达的温度、时间、IPTG 浓度等外界条件，也可改善NMNAT2重组蛋白的表达情况。NMNAT作为调节体内NAD水平的关键酶，在神经退行性疾病治疗、能量代谢和信号通路中起重要作用。最终获得的高纯度酶活性的NMNAT2重组蛋白，为深入研究NMNAT2在神经保护功能、酶蛋白的活性调控、轴突退变和神经退行性疾病中的分子机制奠定了基础。

[1] Balducci E,Emanuelli M,Raffaelli N,etal.Assay methods for nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase of wide applicability[J].Anal Biochem,1995,228(1):64-68.

[2] Lau C,Niere M,Ziegler M.The NMN/NaMN adenylyltransferase (NMNAT) protein family[J].Front Biosci (Landmark Ed),2009,14(14):410-431.

[3] Kitaoka Y,Munemasa Y,Kojima K,etal.Axonal protection by Nmnat3 overexpression with involvement of autophagy in optic nerve degeneration[J].Cell Death Dis,2013,4:e860.

[4] Musiek ES,Xiong DD,Patel T,etal. Nmnat1 protects neuronal function without altering phospho-tau pathology in a mouse model of tauopathy[J]. Ann Clin Transl Neurol, 2016, 3(6): 434-442.

[5] Milde S,Coleman MP.Identification of palmitoyltransferase and thioesterase enzymes that control the subcellular localization of axon survival factor nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase 2 (NMNAT2)[J].J Biol Chem,2014,289(47):32858-32870.

[6] Feng Y,Yan T,He Z,etal.Wld(S),Nmnats and axon degeneration-progress in the past two decades[J].Protein Cell,2010,1(3):237-245.

[7] Ali YO,Li-Kroeger D,Bellen HJ,etal.NMNATs,evolutionarily conserved neuronal maintenance factors[J].Trends Neurosci,2013,36(11):632-640.

[8] Ito Y,Ofengeim D,Najafov A,etal.RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS[J].Science,2016,353(6299):603-608.

[9] Yan T,Feng Y,Zheng J,etal.Nmnat2 delays axon degeneration in superior cervical ganglia dependent on its NAD synthesis activity[J].Neurochem Int,2010,56(1):101-106.

[10]Feng Y,Yan T,Zheng J,etal.Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in mauthner cells by single-cell electroporation delays axon degeneration in live zebrafish[J].J Neurosci Res,2010,88(15):3319-3327.

[11]Gilley J,Adalbert R,Yu G,etal.Rescue of peripheral and CNS axon defects in mice lacking NMNAT2[J].J Neurosci,2013,33(33):13410-13424.

[12]Milde S,Gilley J,Coleman MP.Axonal trafficking of NMNAT2 and its roles in axon growth and survival in vivo[J].Bioarchitecture,2013,3(5):133-140.

[13]Khan JA,Forouhar F,Tao X,etal.Nicotinamide adenine dinucleotide metabolism as an attractive target for drug discovery[J].Expert Opin Ther Targets,2007,11(5):695-705.

[14]Slivicki RA,Ali YO,Lu HC,etal.Impact of genetic reduction of NMNAT2 on chemotherapy-induced losses in cell viability in vitro and peripheral neuropathy in vivo[J].PLoS One,2016,11(1):e0147620.

[15]Soldevila-Barreda JJ,Romero-Canelón I,Habtemariam A,etal.Transfer hydrogenation catalysis in cells as a new approach to anticancer drug design[J].Nat Commun,2015,6:6582.

[16]D'Angelo I,Raffaelli N,Dabusti V,etal.Structure of nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase:a key enzyme in NAD(+) biosynthesis[J].Structure,2000,8(9):993-1004.

[17]Conforti L,Gilley J,Coleman MP.Wallerian degeneration:an emerging axon death pathway linking injury and disease[J].Nat Rev Neurosci,2014,15(6):394-409.

(学术编辑：吴碧华)

Expression, purification and determination of enzyme activity of human recombinant nicotinamide mononucleotide Adenylyltransferase-2

WANG Zhi-han1,REN Li2,ZHAO Liang2

(1.TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092;2.DepartmentofNeurosurgery,ShanghaiPudongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai201300,China)

Objective：To induce the expression of nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase-2 (NMNAT2) through E.coli system,and to determine the enzyme specific activity of purified recombinant NMNAT2 apoenzyme in catalyzing the biosynthesis of nicotinate adenine dinucleotide (NAD).Methods：Under the optimized condition of E.coli BL21 (DE3) system,NMNAT2 recombinant protein was induced to express.The target protein was purified using Ni-NTA Superflow Kit,and was indentified using Western blot method.Besides,its catalysate NAD was measured by enzyme-linked assay,and the enzyme actively was also determined.Results：The human recombinant plasmid construct NMNAT2-pET-24a could be induced to express in E.coli BL21 (DE3) system.The induction conditions were:LB broth (kanamycin,15 μg/mL) in 37 ℃,IPTG (1.0 mM) for 4 hours.And the purified recombinant protein NMNAT2 had high enzyme activity.Conclusion：NMNAT2-pET-24a can be expressed stably in E.coli BL21 (DE3) system.The purified recombinant protein NMNAT2 with higher activity can be obtained under the optimized condition,which can be applied in the study of neuroprotective function and regulation of apoenzyme activity.

Nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase 2;Purification;Enzyme activity;Axonal degeneration;Neuroprotection

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.02.016

上海市浦东新区卫生系统重点专科建设项目(PWZz2013-18)

2017-02-12

王之涵(1982-)，男，主治医师。

任力，E-mail: slysw@sina.com

时间：2017-5-5 16∶46

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170505.1646.030.html

1005-3697(2017)02-0209-05

R741.0

A