路明亮，黄 华，李 俊，史燕妹，林 玲，李新华，刘国彬，傅 燕，李汝懿

昆明医科大学第二附属医院消化内科，云南 昆明 650101

结直肠癌及癌旁组织中miR-338-3p及MACC1的表达变化及意义

路明亮，黄 华，李 俊，史燕妹，林 玲，李新华，刘国彬，傅 燕，李汝懿

昆明医科大学第二附属医院消化内科，云南 昆明 650101

目的观察结直肠癌组织中miR-338-3p与结直肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)的表达变化，并探讨其意义。方法收集昆明医科大学第二附属医院2015年1月-2015年5月外科手术切除并经病理证实的15例结直肠癌患者，手术时留取癌组织及癌旁组织，采用实时荧光定量 PCR 检测miR-338-3p的表达，免疫组化检测MACC1的表达，双荧光素酶报告检测miR-338-3p与MACC1。结果结直肠癌组织及癌旁组织中miR-338-3p的相对表达量分别为0.022±0.005和0.071±0.002，差异有统计学意义(P<0.05)；MACC1 在结直肠癌组织中的阳性表达率(66.7%)显著高于癌旁组织(20.0%)，差异有统计学意义(P<0.01)；miR-338-3p与MACC1的表达呈负相关(r=-0.798，P<0.01)，miR-338-3p抑制MACC1的表达。结论miR-338-3p 可能通过转录后基因沉默机制抑制MACCI的表达，从而抑制结直肠癌的发生。

结直肠癌；微小 RNA；结直肠癌转移相关基因

微小 RNA(miRNA) 是真核生物中一类长约 22个核苷酸的非编码小分子 RNA，在人体组织中广泛表达，其对增殖、分化、死亡等基本细胞过程具有重要的调控作用[1-2]。miR-338-3p是最近发现的一种 miRNA，其在结直肠癌中的表达情况及其调控靶目标的表达情况还鲜有报道。结直肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1)作为最新被鉴定并报道的促癌基因，其表达水平的高低对结直肠癌的转移和生存期有很高的预测价值。本研究检测了结直肠癌组织中miR-338-3p和MACC1的表达，为进一步研究两者之间可能的内在调控关系提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集昆明医科大学第二附属医院2015年1月-2015年5月外科手术切除并经病理证实的15例结直肠癌患者，手术时留取癌组织及癌旁组织(距癌肿5 cm的结肠组织)，男9例，女6例，年龄(52.47±9.31)岁， <40岁 2例，40～60岁 10例，>60岁3例(见表1)。

1.2 引物设计与合成应用Primer 5.0软件设计miR-338-3p的上、下游引物序列，引物由Western biotechnology提供。miR-338-3p：5′-UCCAGCAUCAGUGAUUUUGUUG-3′；338-3p RT：5′-GCGCGTGAGCAGGCTGGAGAAATTAACCACGCGCCAACAA-3′；338-3p F：5′-GGTCCAGCATCAGTGA; R:5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6 RT primer：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;U6 F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′；U6 R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTG-3′。

表1 患者基线资料

Tab 1 Baseline data of patients

变量构成比(%)性别 男9(60.0) 女6(40.0)年龄(岁) 中位数(IQR)53(35～65) x±s52.47±9.31年龄(岁) <402(13.3) 40～6010(66.7) >603(20.0)部位 直肠9(60.0) 乙状结肠1(6.70) 降结肠0(0) 横结肠2(13.3) 升结肠1(6.70) 回盲部2(13.3)分化程度 高分化2(13.3) 中分化8(53.3) 低分化5(33.3)淋巴结转移 有6(40.0) 无9(60.0)

1.3 miR-338-3p的检测应用实时荧光定量PCR技术，用Trizol抽取标本组织中的总RNA，反转录反应条件的设置：25 ℃ 10 min， 42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min；荧光定量PCR扩增条件的设置：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循环35次，72 ℃检测信号。CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。△Ct=miR-338-3p Ct-U6-1Ct，相对表达量=2-△△Ct。

1.4 MACC1的检测切片脱蜡至水后，3%H2O2处理10 min，蒸馏水洗2 min×3次进行抗原修复，消除内源性过氧化物酶的活性，滴加MACC1多克隆抗体孵育过夜，DAB显色。以PBS缓冲液代替一抗的结直肠癌组织免疫组化结果作为阴性对照。MACC1 染色主要根据评分标准评价，其主要依据是 MACC1定位于核和/或胞质，染色强度(阴性、弱、中等和强阳性)和阳性细胞百分比。阳性组为阳性细胞数>20%，<20%为阴性组。染色结果由2名病理学高级职称医师负责阅片，结果需统一，如果有差异，需经讨论后达成共识。由2名高级病理医师判断结果。

1.5 双荧光素酶检测

1.5.1 实验分组：pmir-MACC1-WT+ NC；pmir-MACC1-WT+miR-338 mimics；pmir-MACC1-MUT+mimics NC；pmir-MACC1-MU+ miR-338 mimics。

1.5.2 载体构建：引物序列MACC1-UTR-WT-F: 5′-CTAGCTGGGATATTTGGTATGCTGGCAATGTCTAGC-3′,MACC1-UTR-WT-R: 5′-TCGAGCTAGACATTGCCAGCATACCAAATATCCCAG-3′,MACC1-UTR-MUT-F:5′-CTAGCTGGGATATTTGGTATGCACGCAATGTCTAGC-3′,MACC1-UTR-M UT-R: 5′-TCGAGCTAGACATTGCGTGCATACCAAATATCCC AG-3′。

1.5.3 质粒转染：(1)将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。(2)16 h后，转染荧光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品3次重复。(3)配制DNA和转染试剂，Firely ∶Renilla ∶转染试剂=0.1 μg ∶0.01 μg ∶0.25 μl。(4)配制RNA和转染试剂稀释液，RNA的终浓度为100 nmol/L，转染试剂每孔0.25 μl。(5)稀释好的DNA和RNA分别与转染试剂常温孵育5 min。(6)将稀释好的DNA和RNA混匀，常温孵育20 min。(7)每孔弃去50 μl培养基，将25 μl DNA转染混合液和25 μl RNA转染混合液分别添加到每孔细胞样品中。(8)转染6 h后，换新鲜完全培养基。(9)质粒共转染48 h后，弃去培养基，用100 μl PBS清洗1次；每孔加50 μl稀释好的PLB，摇床常温条件下摇15 min，进行裂解。(10)在白色不透光的96孔酶标板中每孔加上一步骤中上清液10 μl，加入100 μl预混的LARⅡ，2 s后测数据; 每孔添加100 μl预混的Stop&Glo Reagent，静止2 s后，测定数据。检测过程均在避光条件下进行。

1.6 统计学处理采用SPSS 19.0软件包进行统计学处理，采用χ2检验或t检验进行统计分析, 相关性分析用Spearman 相关分析法。P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2 结果

结直肠癌组织中miR-338-3p表达量为0.022±0.005，而癌旁组织中miR-338-3p的表达量为0.071±0.002，差异有统计学意义(P<0.05)；MACC1的阳性信号定位于癌细胞胞浆，在15例结肠癌组织中有 10例为阳性，占 66.7%，对应癌旁组织中有3例为阳性，占 20.0%，MACC1 在结肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)(见图1)。miR-338-3p与MACC1的表达呈负相关(r=-0.798，P<0.01)。共转野生型MACC1基因3′UTR和miR-338-3p组织中，相对荧光活性受到抑制，而突变型荧光表达未受显著影响(P<0.01)(见图2)。

注：病理图片由李汝懿提供。

图1 MACC1 在结肠癌和癌旁组织中的表达(200×)

A：癌旁组织；B：结直肠癌组织

Fig 1 The expression of MACC1 in colorectal carcinoma tissues and adjacent non-tumorous tissues

A: adjacent non-tumorous tissues; B: colorectal carcinoma tissues

注：萤火虫荧光素酶活性以海肾荧光素活性做归一化处理，**P<0.01。

图2 双荧光素酶检测结果
Fig 2 The result of pual luciferase

3 讨论

miR-338-3p是近期发现的定位于染色体17q25.3，由22个核苷酸组成，在不同物种间具有高度保守性的单链非编码RNA小分子，由凋亡相关络氨酸激酶(AATK)第8内含子编码剪切为成熟的miRNA序列miR-338-3p和miR-338-5p[3]，相关研究[4]表明，染色体17q23-25常为多种恶性肿瘤的突变“热点”，其突变后的遗传表型常与肿瘤的血管生成密切相关，同时与肿瘤血管侵袭和远处侵袭转移等恶性生物学行为密不可分，提示miR-338-3p可能参与了多种恶性肿瘤侵袭转移的过程。本研究显示： miR-338-3p在结直肠癌组织的表达水平显著低于癌旁组织，提示miR-338-3p基因表达的缺失可能参与了结直肠癌的发生、发展。也有学者[5]曾采用液相芯片技术检测发现，miR-338-3p在肝细胞癌组织中的表达显著下调。说明miR-338-3p可能是一种与结直肠癌发生、发展密切相关的抑癌基因。

MACC1在2009年由Stein等[6]鉴定并首次报道。MACC1基因定位于人基因组7号染色体(7p21.1)，包含7个外显子和6个内含子，其编码序列含有2 559个核苷酸，经翻译后形成含821个氨基酸的MACC1蛋白。MACC1作为最新被鉴定并报道的促癌基因，其表达水平的高低对结直肠癌的转移和生存期有很高的预测价值。它通过转录调节提高上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的表达，激活肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)/MET信号途径，从而刺激肿瘤细胞增殖，提高细胞运动力，促进肿瘤转移。之前的体外试验显示阻断 MACC1 可显著抑制鼻咽癌细胞增殖、运动、侵袭和克隆形成并诱导凋亡[7]，MACC1在胃癌中的表达高于癌旁组织[8]，在肝癌组织中的表达显著高于非癌组织[9]。本研究结果显示：MACC1在结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，提示MACC1在结直肠癌的发生、发展过程中有一定作用，也有研究[10]支持本研究结果，如存在远处转移的患者血液中MACC1的水平升高。

miRNA主要通过切割降解和翻译抑制两种机制来调控其靶基因的转录后表达。本研究证实，MACC1在结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，而miR-338-3p在结直肠癌组织的表达水平显著低于癌旁组织，结合miR-338-3p与MACC1的表达呈负相关，推测miR-338-3p 表达下调，未能转录后抑制MACC1的表达，从而促进了结直肠癌的发生、发展。

综上所述，miR-338-3p在结直肠癌组织的表达明显下调，MACC1的表达上调，miR-338-3p 可能通过转录后基因沉默机制抑制MACC1的表达，从而抑制结直肠癌的发生，对结直肠癌治疗特别是存在远处转移的治疗提供新思路、新靶点。

[1]Sun K, Wang W, Zeng JJ, et al. MicroRNA-221 inhibits CDKN1C/p57 expression in human colorectal carcinoma [J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(3): 375- 384.

[2]Sassen S, Miska EA, Caldas C. MicroRNA: implications for cancer [J]. Virchows Arch, 2008, 452(1): 1-10.

[3]黄晓卉, 陈连周, 苏乔, 等.miR-338-3p在肝癌组织中的表达及意义[J].中华普通外科学文献 (电子版), 2011, 5(6): 465-470. Huang XH, Chen LZ, Su Q, et al. Expression and significance of miR -338 in hepatocellular carcinoma tissue samples [J].Chin Arch Gen Surg(Electronic Edition), 2011, 5(6): 465-470.

[4]Tsuchiya S, Oku M, Imanaka Y, et al. MicroRNA-338-3p and microRNA-451 contribute to the formation of basolateral polarity in epithelial cells [J]. Nucleic Acids Res, 2009, 37(11): 3821-3827.

[5]Huang XH, Wang Q, Chen JS, et al. Bead-based microarray analysis of microRNA expression in hepatocellular carcinoma: miR-338 is down-regulated [J]. Hepatol Res, 2009, 39(8): 786-794.

[6]Stein U, Walther W, Arlt F, et al. MACC1, a newly identified key regulator of HGF-MET signaling, predicts colon cancer metastasis [J]. Nat Med, 2009, 15(1): 59-67.

[7]Meng F, Li H, Shi H, et al. MACC1 down-regulation inhibits proliferation and tumourigenicity of nasopharyngeal carcinoma cells through Akt/β-Catenin signaling pathway [J].PLoS One, 2013, 8(4): e60821.

[8]Wang L, Wu Y, Lin L, et al. Metastasis-associated in colon cancer-1 upregulation predicts a poor prognosis of gastric cancer, and promotestumor cell proliferation and invasion [J]. Int J Cancer, 2013, 133(6): 1419-1430.

[9]Qiu J, Huang P, Liu Q, et al. Identification of MACC1 as a novelprognostic marker in hepatocellular carcinoma [J]. J Transl Med, 2011, 9(1): 166.

[10]Stein U, Burock S, Herrmann P, et al. Circulating MACC1 transcriptsin colorectal cancer patient plasma predict metastasis and prognosis [J]. PLoS One, 2012, 7(11): e49249.

(责任编辑：马军)

Expressions and significance of miR-338-3p and MACC1 in colorectal carcinoma and adjacent non-tumorous tissues

LU Mingliang, HUANG Hua, LI Jun, SHI Yanmei， LIN Ling, LI Xinhua, LIU Guobin, FU Yan, LI Ruyi

Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650101, China

Objective To observe the expressions of miR-338-3p and MACC1 in colorectal carcinoma tissues and to investigate the significance.Methods The colorectal carcinoma tissues and adjacent non-tumorous tissues were collected (15 patients) respectively in the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University from Jan. 2015 to May. 2015, which were confirmed by pathology. MiR-338-3p was detected by Real-time quantitative PCR. MACC1 was detected by immunohistochemical technique. The correlation between miR-338-3p and MACC1 was detected by pual luciferase report system.Results The expressions of miR-338-3p in colorectal carcinoma tissues and adjacent non-tumorous tissues were 0.022±0.005 and 0.071±0.002, respectively, the difference was significant (P<0.05); the positive rate of MACC1 in colorectal carcinoma (66.7%) was higher than that in adjacent non-tumorous tissues(20.0%) (P<0.01); there was negative correlation between miR-338-3p and MACC1 (r=-0.798，P<0.01). MiR-338-3p inhibited the expression of MACC1.Conclusion MiR-338-3p may inhibit the MACC1 expression by post-transcriptional gene silencing to interdict the occurrence and progress of colorectal carcinoma.

Colorectal carcinoma; Micro-RNA; Metastasis-associated in colone cancer-1

云南省应用基础研究计划项目(2013FB155)

路明亮，博士，副教授，研究方向：消化内科。E-mail:24681262@qq.com

傅燕，主任医师，硕士，研究方向：胃肠道肿瘤的内镜诊治。E-mail:ky_fuyan@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.02.005

R735.3+4

A 文章编号：1006-5709(2017)02-0139-03

2016-09-20