吴 也，王许梦，林 乐，凌保东,2，廖洪利,2*

(1.成都医学院药学院，四川 成都 610083；2.四川省高校结构特异性小分子药物重点实验室，四川 成都 610500)

抗肿瘤环九肽crourorb A1的固相合成

吴 也1，王许梦1，林 乐1，凌保东1,2，廖洪利1,2*

(1.成都医学院药学院，四川 成都 610083；2.四川省高校结构特异性小分子药物重点实验室，四川 成都 610500)

通过Fmoc固相合成法，以Rink Amide MBHA 树脂为载体、Fmoc-Asp-OAll为起始原料、DIEA/HCTU为缩合体系，按照crourorb A1的氨基酸序列由C端向N端依次偶联后，在树脂上实现环合，切割后经制备型RP-HPLC纯化，得到纯度为98%的抗肿瘤环九肽crourorb A1，总收率34%。

crourorb A1；抗肿瘤；固相合成；环肽

大戟科巴豆属，分布于热带和亚热带地区，包含1 300多种草药、灌木和乔木[1-2]。其中，巴豆属海厄戟木(Croton urucuranaBaillon)被广泛种植于巴西中西部，当地人称之为“龙血树”[3]，该树流有红色乳液，有止痛、消炎[4]、抗溃疡[5]、抗菌[6]和抗肿瘤[7-8]等药理活性，具有重要的民族药理学意义。但对于乳液的有效成分却鲜有研究，直到Cndidobacani等[9]从乳液中分离得到一种新型环九肽crourorbA1，其具有阿霉素相当的细胞毒性，这使得该环肽有望成为新的抗肿瘤药物。

crourorbA1由9个氨基酸残基构成，结构为：Cyclic[Asn-Gly-Phe-Ala-Gly-Leu-Ser-Gly-Leu](图 1),相对分子质量为816.90 Da。国内外关于crourorb A1的全合成未见文献报道。作者首次采用Fmoc固相合成法，通过天冬氨酸的正交保护在树脂上实现环合，切割后获得目标产物。

图 1 crourorb A1的结构式

1 实验

1.1 试剂与仪器

Fmoc-氨基酸、Rink Amide MBHA树脂、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，上海吉尔生化有限公司；N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt)、(7-氮杂苯并三唑-1-氧)三吡咯磷六氟磷酸盐(PyAOP)、N-甲基吗啉(NMM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、三氟乙酸(TFA)、苯硅烷、四(三苯基膦)钯(0)(Pd[P(Ph)3]4)，北京百灵威科技有限公司；茚三酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、哌啶均为市售分析纯试剂；乙腈为色谱纯。

气浴恒温振荡器，常州国宇仪器制造有限公司；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵、2ZX-4型旋片真空泵，上海豫康科教仪器设备有限公司；低温冷却循环泵，上海东玺制冷仪器设备有限公司；LD5-2A型低速离心机，北京京立离心机有限公司；LC-6A型制备液相色谱仪、Prominence LC-20AD型高效液相色谱仪，岛津公司；6538 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS质谱仪，安捷伦公司。

1.2 方法

crourorb A1的固相合成路线见图2。

图 2 crourorb A1的固相合成路线

1.2.1 crourorb A1的直链合成

取Rink Amide MBHA树脂500 mg(载样量为0.27 mmol·g-1)加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡20 min使树脂充分溶胀，抽干待用。加入20%哌啶/DMF溶液10 mL，振荡10 min × 2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。随后将Fmoc-Asp-OAll(395 mg，1 mmol)、HCTU(372 mg，0.9 mmol)和DIEA(350μL，2 mmol)混溶于7 mL DMF，加入到树脂中，振荡1 h，抽滤后依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次，加入5 mL醋酸酐/吡啶混合溶液封闭20 min，乙酰化所有未反应的树脂。之后根据多肽序列加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH，重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完成。缩合过程中通过茚三酮显色监测反应进程。

1.2.2 树脂上环合

直链完成后，将Pd[P(Ph)3]4(2 eq)、苯硅烷(5 eq)溶于7 mL DCM，加入到树脂中，避光振荡3 h，脱去Asp上的烯丙基[10]。抽滤后依次用DCM、DMF洗涤树脂各5次，脱Fmoc保护，加入HOAt(5 eq)、PyAOP(5 eq)、NMM(10 eq)和7 mL NMP，振荡环合，24 h后抽滤重复一次。

1.2.3 切割与脱保护

将树脂洗净抽干，加入TFA∶DCM =9∶1(体积比)混合溶剂15 mL，振荡2 h，过滤，用少许TFA洗涤树脂，加入30 mL冰乙醚，0 ℃静置过夜，3 000 r·min-1离心3 min，弃上清液，重复2次，自然风干即得crourorb A1粗品。

1.2.4 crourorb A1的分离纯化

将粗肽用甲醇溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。色谱条件：制备柱Grace Vydac Peptide C18柱(250 mm× 10 mm，10μm)；检测波长214 nm；流动相A为0.1% TFA乙腈溶液，流动相B为0.1% TFA水溶液，梯度洗脱(0～40 min，流动相B：90%～0%)；流速4.0 mL·min-1。收集主峰，冷冻干燥后得到纯品37 mg，

为白色粉末，总收率34%。

1.2.5 crourorb A1的分析与表征

对crourorb A1纯品进行HPLC分析。测试条件：分析柱Grace Vydac Protein & Peptide C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；检测波长214 nm；流动相A为0.1% TFA乙腈溶液，流动相B为0.1% TFA水溶液，梯度洗脱(0～35 min，流动相B：90%～0%)；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃。

对crourorb A1纯品进行HR-Q-TOF-MS测试。

2 结果与讨论

2.1 HPLC分析(图 3)

图 3 crourorb A1纯品的HPLC图谱

由图3可知，crourorb A1纯品保留时间为15.274 min，经计算其纯度为98%。

2.2 质谱分析(图 4)

图4 crourorb A1纯品的HR-Q-TOF-MS图谱

由图4可知，分子离子峰[M+H]+= 817.4204，[M+Na]+=839.4017，crourorb A1分子量与理论值816.90相符。

3 结论

采用Fmoc固相合成法，以Rink Amide MBHA 树脂为载体、Fmoc-Asp-OAll为起始原料、DIEA/HCTU为缩合体系，按照crourorb A1的氨基酸序列由C端向N端依次偶联后，在树脂上实现环合，切割后经制备型RP-HPLC纯化，得到纯度为98%的抗肿瘤环九肽crourorb A1，总收率34%。相比液相环合，固相合成操作更简单适用，避免了环合时肽与肽之间的缩合以及后处理的诸多麻烦。本合成方法为crourorb A1进一步的药理学、药效学研究提供原料，并为含有天冬酰胺的环肽药物规模化生产提供参考。

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Solid-Phase Synthesis of Crourorb A1 of Anti-Tumor Cyclic Nanopeptide

WU Ye1，WANG XU-meng1，LIN Le1，LING Bao-dong1,2，LIAO Hong-li1,2*

(1.SchoolofPharmacy，ChengduMedicalCollege，Chengdu610083，China；2.KeyLaboratoryNamedSpecialStructureSmallMoleculeDrugsinUniversityofSichuanProvince，Chengdu610500，China)

UsingFmocsolid-phasepolypeptidesynthesis(SPPS)withRinkAmideMBHAresinasasolidsupport，Fmoc-Asp-OAllasastartingmaterial，andDIEA/HCTUasacondensationsystem，crourorbA1wassynthesizedaccordingtoitsamineacidsequenceformC-terminaltoN-terminalbysequentialcouplingandcyclizationontheresin.Aftercleavage，theanti-tumorcyclicnanopeptidewaspurifiedbypreparativeRP-HPLCwithafinalpurityof98%andyieldof34%.

crourorbA1；anti-tumor；solid-phasesynthesis；cyclicpeptide

四川省高校科研创新团队项目(13TD0028),国家大学生创新创业训练计划项目(201513705024)

2016-10-24

吴也(1990-)，男，四川达州人，硕士研究生，研究方向：抗肿瘤药物合成，E-mail：jjcwf@126.com；

廖洪利，副教授，E-mail：liaohl213@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.008

R979.1 R914.5

A

1672-5425(2017)03-0031-04

吴也，王许梦，林乐,等.抗肿瘤环九肽crourorb A1的固相合成[J].化学与生物工程，2017，34(3)：31-34.