李阳　成家杨　钟钰　唐杰

摘要：【目的】通过研究浮萍物种多样性对净化富营养化水体效果及其对浮萍生物质积累的影响，为未来利用浮萍混养组合修复富营养化水体及开发浮萍生物质提供理论依据。【方法】分别将青萍（Lemna aequinoctialis LC33）、少根紫萍（Landoltia punctata LC06）和多根紫萍（Spirodela polyrhiza LC15）進行单独和混合培养，测量其对富营养化水体中氮、磷的去除率，同时分析混养组合的生物质含量。【结果】由少根紫萍和多根紫萍构成的混养组合对水体中硝氮（NO3--N）、总氮（TN）和总磷（TP）的去除率最高，分别为97.05%、95.00%和97.64%；由3种浮萍构成的混养组合对水体中氨氮（NH4+-N）的去除率最高，达98.17%。由青萍和少根紫萍构成的混养组合及由少根紫萍和多根紫萍构成的混养组合具有更高的生物量增长率，由青萍和少根紫萍构成的混养组合可积累更多的淀粉，由少根紫萍和多根紫萍构成的混养组合可积累更多的粗蛋白。【结论】适当的浮萍混养搭配不仅可提高富营养化水体净化效果，还能促进生物质的积累。

关键词： 浮萍；混合培养；植物修复；氮磷去除率；生物质

中图分类号： TK6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0259-07

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for eutrophic water purification and duckweed biomass utilization in the future， the effects of duckweed species diversity on eutrophic water purification and duckweed biomass accumulation were investigated. 【Method】Three duckweed species， Lemna aequinoctialis LC33， Landoltia punctata LC06 and Spirodela polyrhiza LC15， were cultured both individually and in mixture to measure their removal rates of nitrogen and phosphorus， and to analyze biomass content of mixed combinations. 【Result】Combination of L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 showed the highest removal efficiency of nitrate nitrogen（NO3--N）， total nitrogen（TN） and total phosphorus（TP）， reaching 97.05%、95.00% and 97.64% respectively； while combination of L. aequinoctialis LC33， L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 showed the highest removal efficiency of ammonia nitrogen（NH4+-N）， reaching 98.17%. Moreover， compared with other groups， polyculture of L. aequinoctialis LC33 and L. punctata LC06， polyculture of L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 exhibited higher biomass growth rate； polyculture of L. aequinoctialis LC33 and L. punctata LC06 accumulated more starch； polyculture of L. punctata LC06 and S. polyrhiza LC15 accumulated more crude protein. 【Conclusion】Appropriate combination of duckweed species can enhance purifying effects of eutrophic water， and promote biomass accumulation.

Key words： duckweed； mixed culture； phytoremediation； nitrogen and phosphorus removal efficiency； biomass

0 引言

【研究意义】近年来，水体富营养化已成为一个世界性的环境问题（高爱环等，2005），而水生植物浮萍因具有氮磷去除率高、生长速度快、环境适应性强、易收获等优点，已广泛应用于富营养化水体修复（鄢恒珍等，2009； Cheng and Stomp， 2009； Megateli et al.， 2009； Khellaf and Zerdaoui， 2010； Stout et al.， 2010）和生物能源等领域。野生浮萍多以两种或多种浮萍种类聚集在一起的方式生长，但目前对浮萍净化污水方面的研究多采用单一浮萍物种，对混养组合的污水净化能力及其生物质积累能力尚不清楚。因此，探索浮萍混养组合在净化污水方面的效果及积累生物质的情况将填补这一领域的空白，为更好地进行污水处理和利用浮萍生物质提供理论支持。【前人研究进展】目前，国内外对单一浮萍物种在生物质开发、污水处理等方面的研究已十分成熟。种云霄等（2003）研究发现，稀脉浮萍的最适pH为5.0～6.0，而当pH<6.0时，紫萍基本不能生长；Cheng等（2002）利用人工合成的养猪场废水进行筛选后发现，紫萍（Spirodela punctata 7776）可在含NH4-N/L 240 mg和PO4-P 31 mg/L的废水中存活，且积累最多的蛋白质；Suppadit（2011）在用芜萍（Wolffia arrhiza）处理农场废水时发现，当生物量密度为12.0 g/L、处理周期为30 d时，芜萍生长最快；Ge等（2012）研究发现，浮萍在饥饿条件下可积累更多的淀粉。但由于不同地域、不同品种浮萍在污水净化和生物质积累方面存在明显差异，因此研究结果也存在差异。于斌（2010）研究发现，扬州地区的稀脉浮萍对稀释畜禽废水中氮、磷的去除能力强于少根紫萍，去除率最高可达74.92%和88.00%；毛杉杉等（2012）研究得出浙江浮萍属（Lemna）植株在污水处理和淀粉积累能力等方面均强于紫萍属（Spirodela）植株的结论；鲍姝等（2014）研究户外条件下云南本地4个浮萍品种的氮磷含量及氮磷固定能力存在明显的种属差异。虽然Su等（2012）的研究表明长时间保持单一浮萍物种用于污水净化控制系统的效果不理想，但目前利用浮萍处理污水的研究仍以单一浮萍株系为主，关于浮萍混养组合方面的研究报道仅有1篇，即Zhao等（2014）测量了青萍（L. minor OT）和少根紫萍（L. punctata OT）混养组合在不同生长条件下的生物量，发现混养组合在弱光照条件下可积累更多的淀粉；同时考察了少根紫萍（L. punctata C3）、青萍（L. minor C2）和多根紫萍（S. polyrhiza C1）3种浮萍相互搭配组成的混养组合对养猪场废水中氮磷的去除率，发现所有的混合组合中，少根紫萍和青萍组成的混养组合具有最高的氮磷去除率和生物质产量。上述研究结果表明，恰当的浮萍混养组合可提高其污水净化能力和生物量，从而加强植物修复效果。【本研究切入点】虽然单一浮萍品种对水体中氮、磷的净化及积累生物质的能力已经得到证实，但浮萍混养组合对污水的净化能力和其生物质积累情况尚缺乏系统性研究。【拟解决的关键问题】以安徽省合肥市巢湖流域的3种浮萍（青萍、少根紫萍和多根紫萍）为研究对象，通过单独培养和混合培养、调查浮萍物种多样性对模拟污水中氮、磷去除的影响及其对浮萍生物质（生物量、淀粉和蛋白质）积累的影响，揭示不同组合浮萍净化水质的能力和特点及其生物质积累能力。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试浮萍材料均采集自安微省合肥市巢湖流域，分别为青萍（Lemna aequinoctialis LC33）、少根紫萍（Landoltia punctata LC06）和多根紫萍（Spirodela polyrhiza LC15）（Tang et al.， 2015）。將浮萍样品清洗干净后，用0.5% NaClO溶液消毒1 min，转入稀释10倍的Hoagland培养液[大量元素：680.00 mg/L KH2PO4+

1515.00 mg/L KNO3+1180.00 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+

492.00 mg/L MgSO4·7H2O；微量元素：2.85 mg/L H3BO3+

3.62 mg/L MnCl2·4H2O+0.22 mg/L ZnSO4·7H2O+

0.08 g/L CuSO4·5H2O+0.12 mg/L Na2MoO4·2H2O；其他：酒石酸3.00 mg/L]中，放入光照培养箱培养两周。光照培养箱环境条件设置为：温度25 ℃，光照强度5000 lx，光照时间16 h。待其生物量扩大后挑选健康植株，供后续试验使用。

1. 2 模拟富营养化水体

结合我国主要水体富营养化的水质特征（奚姗姗等，2016），以Hoagland培养液为基础，模拟富营养化水体，其中总氮（TN）浓度为9.48 mg/L，总磷（TP）浓度为0.72 mg/L。根据孙宜敏（2004）的研究，当硝氮（NO3--N）与氨氮（NH4+-N）的比例为3∶1时，浮萍对TN的去除率最高，因此设NH4+-N浓度为2.37 mg/L，NO3--N浓度为7.11 mg/L。

1. 3 试验设计

选用直径12 cm的不透光塑料桶为试验容器，加入500 mL上述模拟富营养化培养液。初始鲜重投放总量约0.30 g，其中，单种浮萍的投放量为0.30 g，两种浮萍按1∶1的比例各投放0.15 g，3种浮萍按1∶1∶1的比例每种各投放0.10 g，不同浮萍组合的组成见表1。各试验组合均设3个重复，共21桶。根据前期对浮萍生长条件的研究，设试验温度25 ℃，光照强度7000 lx，光照周期16∶8（光照16 h，黑暗8 h），将上述浮萍置于恒温光照生物培养箱内连续培养12 d，每隔2 d采样测定培养液中NH4+-N、NO3--N、TN和TP含量。培养12 d后，测定各浮萍组合的鲜重和干重、淀粉含量、蛋白质含量。培养期间，塑料桶中蒸发的水分可用蒸馏水补充。

1. 4 氮磷去除率测定

培养液中的TN采用碱性过硫酸钾氧化—紫外分光光度法（HJ 636-2012）测定；TP采用过硫酸钾消解—钼酸铵分光光度法（GB 11893-89）测定；NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法（HJ 535-2009）测定；NO3--N采用氨基磺酸紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）测定。去除率计算公式如下：

RE=（C0-Ct）/C0 （1）

式中，RE为营养元素的去除率（Removal efficiency，%），C0为初始时刻的营养元素浓度（mg/L），Ct为t时刻的营养元素浓度（mg/L）。

1. 5 生物量测定

浮萍鲜重（Fresh weight，FW）测定采用Bergmann等（2000）的方法，即用滤水网斗或其他工具将浮萍从水中捞起，除去自由水（无水滴出现），将浮萍置于卫生纸垫上吸水5 min后，用电子天平秤其鲜重。鲜重测定完毕后，将浮萍放于冻干机内冻干24 h，即可测量浮萍干重（Dry weight，DW）。

生物量增长率（g/m2·d）=（收获时鲜重-投入时鲜重）/（培养时间×培养面积）

1. 6 生物质含量测定

1. 6. 1 淀粉含量测定 淀粉含量运用修改后的酶解法（Smith and Zeeman， 2006）进行测定：称取50 mg冷冻干燥后的浮萍干粉于50.0 mL离心管，加入1.5 mL 80%乙醇，混匀，于90 ℃水浴15 min，在室温下离心5 min（12000×g），弃上清液，重复2次上述步骤，直至上清液变澄清；将剩余乙醇蒸发掉，剩余固体转移至容量瓶中，加蒸馏水定容至10.0 mL，混匀，然后取0.5 mL匀浆至2.0 mL EP管，在100 ℃水浴中加热10 min；冷却后加入0.5 mL 200 mmol/L醋酸钠（pH 4.8）、1 μL淀粉葡糖苷酶（A7095）和1 μL α-淀粉酶（A4582），混匀，37 ℃培养4 h；之后，12000×g离心5 min，得到的上清液即为浮萍淀粉水解产生的葡萄糖。葡萄糖含量采用葡萄糖乳酸生物传感分析仪（SBA-40E，山东省科学院研究所）进行测定和分析。淀粉含量计算公式为：

淀粉含量=葡萄糖含量×0.909

1. 6. 2 蛋白质含量测定 浮萍干基蛋白质含量按GI3/T 6432执行（Xiao et al.，2013），计算公式如下：

浮萍蛋白质含量=氮元素含量×6.25

1. 7 统计分析

利用Origin 8.5.1和SPSS 18.0对试验数据进行统计分析，并利用Duncan法进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 对氮磷的去除效果

2. 1. 1 水体NO3--N的去除效果 从图1可看出，在培养的前2 d，所有水体NO3--N含量基本上未发生变化，可能与浮萍刚开始适应环境、仍处在调整期有关。2 d后，浮萍进入快速生长期，对水体NO3--N的吸收率也极大提高，水体NO3--N浓度开始迅速下降。

由表2可知，经过12 d培养后，3种单独培养浮萍对NO3--N的去除能力排序为少根紫萍（96.62%）>多根紫萍（94.80%）>青萍（93.67%）；不同混养组合对NO3--N的去除率分别为95.50%（组合4）、95.08%（组合5）、97.05%（组合6）和95.36%（组合7）。可见，组合5和组合6均表现出较其组合内单种浮萍更高的NO3--N去除率，而其他浮萍混养组合（组合4和组合7）未表现出明显优势。因此，适宜的浮萍混养组合可提高NO3--N的去除率。

2. 1. 2 水体NH4+-N的去除效果 从图2可看出，水体NH4+-N含量在培养过程的前2～3 d下降了50%～60%，且水体中大部分NH4+-N在8 d后已被去除。由表2可知，经过12 d的培养，3种单独培养浮萍对NH4+-N的去除能力排序为少根紫萍（97.61%）>多根紫萍（96.35%）>青萍（95.80%）；不同混养组合对NH4+-N的去除率分别为98.03%（组合4）、97.47%（组合5）、97.23%（组合6）和98.17%（组合7）。除组合6外，其他混养组合（组合4、5和7）对NH4+-N的去除率均高于组合中单种浮萍的NH4+-N去除率。说明适宜的浮萍混养搭配可增强对水体NH4+-N的去除效果。

综合分析2.1.1和2.1.2的结果发现，当水体中同时存在NH4+-N和NO3--N时，浮萍优先利用NH4+-N合成细胞物质（Oron，1994），因此，在培养前期，水体中NH4+-N含量大幅度下降，而NO3--N含量基本未发生变化。之后，当水环境中NH4+-N大量消耗时，浮萍开始吸收NO3--N进行生命活动（Caicedo et al.， 2000），对NO3--N的去除率明显增加。产生这种现象的主要原因可能是细胞利用NH4+-N来合成氨基酸和蛋白质所需能耗较低（Oron， 1994）。

2. 1. 3 水体TN的去除效果 7种浮萍组合对水体TN的去除效果见图3。由表2和图3可知，经过12 d的培养，3种单独培养浮萍对TN的去除能力排序为少根紫萍（94.03%）>多根紫萍（92.14%）>青萍（91.58%）；不同混养组合对TN的去除率分别为94.86%（组合4）、94.30%（组合5）、95.00%（组合6）和93.63%（组合7）。除组合7外，由两种浮萍组成的所有混养组合（组合4、5和6）对TN的去除率均高于单种浮萍的去除率，说明两种浮萍组成的混养组合对TN的去除效果更佳。因此，适宜的浮萍混养组合可提高对水体TN的去除效果。

2. 1. 4 水体TP的去除效果 7种浮萍组合对水体TP的去除效果与对TN的去除效果相似（图4）。在培养的前8 d，所有组合的水体TP含量呈下降趋势，8 d后大部分P被去除；在培养的最后4 d，去除效率明显降低，可能是由于TP浓度过低，不利于浮萍的生长所致。由表2可知，经过12 d的培养，3种单独培养浮萍对TP的去除能力排序为多根紫萍（97.08%）>少根紫萍（95.42%）>青萍（94.17%）；不同混养组合对TP的去除率分别为94.86%（组合4）、97.36%（组合5）、97.64%（组合6）和97.22%（组合7）。除组合4外，其他由2种和3种浮萍组成混养组合（组合5、6和7）对TP的去除率均高于组合中单种浮萍的去除率。说明适宜的浮萍混养组合可增强浮萍对水体TP的去除效果。

综合来看，对NH4+-N、NO3--N和TN的去除，单种浮萍的去除能力排序为少根紫萍>多根紫萍>青萍；对TP的去除能力排序为多根紫萍>少根紫萍>青萍。在所有组合中，组合6（少根紫萍+多根紫萍）对水体中NO3--N、TN和TP的去除率最高，组合7（青萍+少根紫萍+多根紫萍）对NH4+-N的去除率最高。因此，通过适宜的浮萍混养组合可提高水体净化效果。

2. 2 生物质的积累

浮萍的生物质产量对浮萍资源化利用具有重要意义。淀粉是浮萍含量最多的活性成分之一，也是浮萍作为新一代生物能源原料的关键因素。此外，浮萍植物体蛋白质含量也很高，可達干重的45%，且不含毒生物碱，饲料系数约30，是一种很有发展前景的蛋白质饲料源（孔春林和陈宇，2006）。本研究探讨了3种试验浮萍（青萍、少根紫萍和多根紫萍）在单种培养和混合培养组合下生物量、淀粉和蛋白含量的差异。

2. 2. 1 浮萍的生长情况 由表3可知，单种浮萍积累生物量的能力排序为青萍>少根紫萍>多根紫萍，其生物量增长率分别为9.45、8.87和7.83 g/m2·d；不同混养组合生物量增长率分别为9.87（组合4）、9.12（组合5）、9.93（组合6）和9.29 g/m2·d（组合7），其中，组合4的生物量增长率比单种青萍和少根紫萍分别高2.30%和11.27%，组合6的生物量增长率比单种少根紫萍和多根紫萍分别显著高12.00%和26.82%（P<0.05，下同）。说明适宜的浮萍混养组合能促进浮萍生长，提高生物量，其原因可能是种间组合通过竞争机制刺激了浮萍的生长能力。

2. 2. 2 淀粉的积累 由表3可知，青萍、少根紫萍和多根紫萍的淀粉含量差别不明显，分别为13.74%、14.29%和15.99%；不同混养组合的淀粉含量分别为15.28%（组合4）、15.15%（组合5）、15.03%（组合6）和15.69%（组合7），其中，组合4的淀粉含量比单种青萍和少根紫萍显著高11.21%和7.00%，多根紫萍的淀粉含量最高，显著高于除组合7外的其他组合。表明适宜的浮萍混养组合能促进浮萍积累更多淀粉，可能是混合培养提高了整个混养组合的光合作用效率，从而促进了淀粉的积累。

2. 2. 3 蛋白质的积累 由表3可看出，单种浮萍体内的蛋白质含量为青萍>少根紫萍>多根紫萍，其蛋白质含量分别为23.40%、22.19%和20.73%；不同混养组合的蛋白质含量分别为22.65%（组合4）、23.24%（组合5）、23.07%（组合6）和22.44%（组合7），其中，组合5的蛋白质含量最高，与青萍及组合6差异不显著（P>

0.05），组合6的蛋白质含量比单种少根紫萍和多根紫萍显著高4.00%和11.29%。说明适当种类的浮萍混合培养可提高其蛋白质含量，可能是混合培养促进了不同种浮萍间对氮元素的吸收，从而促进了蛋白质的合成。

3 讨论

Zhao等（2014）测量了青萍和少根紫萍的混养组合在不同生长条件下的生物量和淀粉含量，但未对浮萍生物质的主要组成部分蛋白质进行研究。本研究以3种浮萍构成的7种浮萍组合为研究对象，系统地研究浮萍多样性对富营养化水体中多项水质指标及生物质积累的影响，为未来大规模利用浮萍处理富营养化水体提供了理论基础。此外，Zhao等（2014）通过研究少根紫萍、青萍和紫萍相互搭配组成的混养组合对养猪场废水中氮磷去除率，发现少根紫萍和青萍组成的混养组合具有最高的氮磷去除率和生物质产量。本研究发现，不同浮萍混养组合对水体中NH4+-N、NO3--N、TN和TP的去除效果也存在差异。与单种浮萍或3种浮萍构成的混养组合（组合7）相比，两种浮萍构成的混养组合（组合4、5和6）对水体TN的去除率较高；对于NO3--N的去除，青萍+多根紫萍（组合5）及少根紫萍+多根紫萍（组合6）的去除率也高于单种浮萍；对于NH4+-N和TP的去除，除少根紫萍+多根紫萍混养组合对NH4+-N的去除及青萍+少根紫萍混养组合对TP的去除外，其他由2种或3种浮萍混养组合水体中的氮磷含量均低于浮萍单种培养后水体中的氮磷含量。同时，混养浮萍的生物量、淀粉积累量和蛋白质产量均高于单种浮萍。其中，青萍+少根紫萍混养组合的生物量（9.87 g/m2·d）比单种少根紫萍（8.87 g/m2·d）增加11.27%，淀粉含量（青萍+少根紫萍：15.28%；少根紫萍：14.29%）增加7.00%；少根紫萍+多根紫萍混养组合的生物量（9.93 g/m2·d）比单种多根紫萍（7.83 g/m2·d）增加26.82%，蛋白质含量（少根紫萍+多根紫萍：23.07%；多根紫萍：20.73%）增加11.29%。本研究结果表明，不同来源浮萍组成混养体系的富营养化水体净化效果及其生物质产量存在明显差异。因此，筛选适合当地富营养化水体修复的浮萍组合是提高其水体净化效果的关键。

以上研究结果表明，浮萍混合培养是一种有效促进净化富营养化水体能力和增加生物质产量的方法，其促进机理可能是：（1）混合培养增强了浮萍组合抵抗不利环境条件的能力（Griffith et al.， 2011）；（2）浮萍遗传多样性可能会通过选择效应增加高效基因型的概率，从而促进具有抵抗型基因型浮萍的生长（Chen et al.， 2014）；（3）由于不同种类浮萍对氮磷的吸收率不同，混养搭配可使组合中的个体分别利用本身优势，实现资源的互补效应和生态位分化，从而提高整体效果（Crawford and Whitney，2010）。

本研究系统分析了浮萍多样性对富营养化水体净化效果及生物质积累情况的影响，发现适宜的浮萍混养组合可提高对水体TN、TP的净化效果和生物质产量，但对其中的促进机制尚不清楚，今后将从生态学、生理学及分子生物学等角度进一步探索混养组合的代谢机理。

4 结论

适当的浮萍混养搭配不仅可提高富营养化水体净化效果，还能促进生物质的积累。该研究结果为实现生物质生产与环境治理双赢提供了新思路。

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（責任编辑 邓慧灵）