张磊，叶大柠，朱焱，柴海云，朱庆义，陈茶，屈平华(.广州金域医学检验中心有限公司微生物室，广州 500；.新丰县人民医院，广东新丰 500；.福建医科大学附属泉州第一医院检验科，福建泉州 6000；.广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院检验医学部，广州 50006)

·临床实验研究·

10株蜃楼弗朗西斯菌的鉴定与特征分析*

张磊1，叶大柠2，朱焱3，柴海云1，朱庆义1，陈茶4，屈平华4
(1.广州金域医学检验中心有限公司微生物室，广州 510330；2.新丰县人民医院，广东新丰 511100；3.福建医科大学附属泉州第一医院检验科，福建泉州 362000；4.广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院检验医学部，广州 510006)

目的 对10株蜃楼弗朗西斯菌样细菌进行菌种鉴定和特征分析。方法 对环境水源及临床患者样本中分离的10株实验菌株，进行菌体形态和生长特征观察、生化表型鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定和16S rRNA测序分析。E-test方法检测菌株对各种药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果 该10株菌均为着色较淡的革兰阴性小球杆菌；尿素酶阴性、硝酸盐还原试验阴性、V因子和X因子需求试验阴性，氧化酶和触酶试验阳性；在M-H平板和麦康凯平板上不生长，血平板、巧克力平板和BCYE平板上生长迅速，可形成白色不透明型、无色透明型和灰色光滑型，直径约2 mm大小的菌落。16S rRNA基因测序显示，该10株菌与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015同源性在99.6%以上，系统发育分析亦位于同一个分枝上。MALDI-TOF MS分析显示，该10株均含有6 153 m/z、5 180 m/z、7 757 m/z和9 392 m/z等特征峰，与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015类似。采用Vitek 2 GN卡及NH卡、API 20NE及NH试条则可能错误鉴定为少动鞘氨醇单胞菌、灰色奈瑟菌、气味黄杆菌和嗜血杆菌等。药敏试验显示，对氯霉素、多西环素、庆大霉素、四环素、氧氟沙星和环丙沙星等均敏感。结论 该10株菌可鉴定为蜃楼弗朗西斯菌，其生化反应不活泼，常规方法鉴定会发生错误，应予以重视。

蜃楼弗朗西斯菌; 鉴定; 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

蜃楼弗朗西斯菌(Francisellaphilomiragia)是一种革兰阴性球杆菌，主要存在于近海浅海和盐碱地区的咸水源中，可在免疫力低下和免疫屏障受破坏的患者中引起慢性肉芽肿病、骨髓增生性疾病、溺水性肺炎、腹膜炎、脓毒血症和伤口感染等[1-2]。目前，全球范围内仅有40多例蜃楼弗朗西斯菌的临床感染报道[2]，且我国暂未有该菌的分离和菌种鉴定信息。近年来，本课题组通过改良的弗朗西斯菌分离培养方法，先后在我国的环境水样中发现和命名了一个新的另弗朗西斯菌属(Allofrancisella)和3个新菌种[3]。本研究对前期分离保存的8株蜃楼弗朗西斯菌样环境菌分离株和2株临床分离株，以及蜃楼弗朗西斯菌标准菌株ATCC 25015，进行常规生化表型鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析、16S rRNA基因序列分析，最终将该10株菌确定为蜃楼弗朗西斯菌，报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 10株蜃楼弗朗西斯样细菌分别分离于环境水源及临床患者血液样本，部分菌株已获得GenBank登录号。8株环境分离株中除1株分离于集中空调冷却塔水，其余7株均分离自咸水源，样本的前处理和分离培养步骤见参考文献[4]。2株临床分离株则均来自于血培养标本，其中Zhangzhou株分离自一位54岁长期酗酒和多器官功能衰竭男性患者；而Fuzhou株分离自一位62岁糖尿病和骨髓增生的女性患者。弗朗西斯菌ATCC 2015由广东省微生物菌种保藏中心代购。菌株来源和相关信息见表1。Vitek-MS质谱鉴定的校准菌株大肠埃希菌ATCC 8739为法国生物梅里埃公司赠送。

表1 实验菌株来源和相关信息

1.2 主要试剂与仪器 Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪及配套GN卡、NH卡、API 20非肠杆菌科(API 20NE)试条、API奈瑟菌和嗜血杆菌(API NH)试条、Vitek-MS鉴定系统和相关耗材、血平板、巧克平板、头孢硝噻吩纸片、氧化酶纸片(法国生物梅里埃公司)； HTM平板(广州迪景公司)；含L-半胱氨酸的BCYE平板和不含L-半胱氨酸的BCYE平板由本室自配，制备方法见参考文献[5]；ABI Veriti 96孔PCR仪(美国 ABI 公司)；全自动凝胶成像系统(英国Syngene公司)；Taq酶体系、DL 2000 DNA marker(大连TaKaRa公司)；引物合成及测序由上海英捷维基公司完成；E-test试条(温州康泰生物公司)。

1.3 生长特性和菌落形态观察 将10株实验菌株与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015分别接种于血平板、巧克力平板、含L-半胱氨酸的BCYE平板和不含L-半胱氨酸的BCYE平板，置于含5% CO2的35 ℃恒温温育箱培养，观察其在不同培养基上的菌落生长形态。

1.4 生化鉴定 对巧克力平板上培养48 h菌落进行革兰染色、氧化酶和触酶试验，按常规生化鉴定流程，分别采用Vitek 2 Compact GN卡、Vitek 2 Compact NH卡、API 20NE条和API NH条进行鉴定，具体操作参照说明书。采用头孢硝噻吩纸片显色法检测菌株是否产β-内酰胺酶，按试剂说明书进行。

1.5 MALDI-TOF MS分析 取巧克力平板上培养48 h的单个菌落涂布在靶板点位上，加 1 μL Vitek MS-CHCA基质覆盖，提取细菌全细胞蛋白质。靶板每组中心点位涂布大肠埃希菌ATCC 8739，用于该组所有菌株质谱数据的校正。RUO数据库分析得到各株的蛋白质质量指纹图谱，参考弗朗西斯菌蛋白质质谱分析的相关文献[5]进行图谱比较。

1.6 16S rRNA基因扩增及测序鉴定 采用煮沸法提取细菌DNA，即挑取单个菌落置于无菌去离子水中105 ℃ 15 min，13 000×g离心1 min，取上清液作模板。16S rRNA基因基因扩增参考文献[6]进行。PCR扩增产物送上海英捷维基公司进行双向测序。测得的序列以DNA软件进行序列拼接，GenBank数据库中进行NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nhn.nih.gov/Blast.cgi)分析，并下载相关16S rRNA基因参考序列，用Mega 7软件构建系统发育树。

1.7 药敏试验 采用E-test方法，以HTM平板检测庆大霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素等抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，药敏结果判读参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)M45-A2文件中土拉弗朗西斯菌(F.tularensis)的判读折点。

2 结果

2.1 生长特性 10株细菌中除10HL1958在血平板上生长缓慢，在培养48 h始见明显菌落、72～96 h 始形成直径约1～2 mm大小菌落外，其余9株实验菌株在血平板培养48 h即可以形成直径约2 mm大小、突起、边缘整齐、不溶血菌落。巧克力平板和BCYE平板的菌落形态与血平板上菌落形态基本一致。按照菌落表型，可分为包括白色不透明、无色半透明型和灰色光滑型等3种主要菌落表型。见图1。10株菌株除10HL1958在含L-半胱氨酸的BCYE平板生长状态明显优于不含L-半胱氨酸的BCYE平板，即具有L-半氨胱酸生长依赖性外，其余9株菌株和蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015在以上2种培养基上的生长状态无明显区别。所有实验菌株在M-H平板和麦康凯平板上均不生长，与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015和文献描述一致[7]。

注：A，灰色光滑型;B,白色不透明型；C，无色透明型。

图1 实验菌株在嗜血巧克力平板培养96 h的3种菌落表型

2.2 生化表型与鉴定 该10株菌为着色较淡的革兰阴性杆菌和小球杆菌。见图2。触酶弱阳性，氧化酶阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿酶阴性，与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015类似。V因子和X因子需求试验阴性，β-内酰胺酶试验阳性。Vitek 2 Compact GN卡和NH卡、API 20 NE条和NH条的鉴定结果见表2。

图2 蜃楼弗朗西斯菌初步传代革兰染色形态(×1 000)

2.3 MALDI-TOF MS鉴定和分析 10株实验菌株采用Vitek-MS均不能鉴定。经RUO数据库分析和质谱峰图比较发现，10株菌蛋白质质谱指纹与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015类似，其主要蛋白质质谱峰在0～12 000 m/z范围内，且含5 180、6 153、7 757和9 392 m/z等高强度特征峰。见图3。

2.4 16S rRNA基因测序鉴定和序列分析 10株菌和蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015均扩增得到长度约1 500 bp产物。经测序与BLAST分析，该10株临床和环境分离株与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015的16S rRNA基因序列相似度在99.6%以上。而基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树亦显示，该10株临床和环境分离株与蜃楼弗朗西斯菌位于同一个分枝。见图4。

表2 实验菌株常规生化鉴定结果

注：a，28 ℃温育48 h的实验结果；b，少动鞘氨醇单胞菌(51%可能性)，荧光假单胞菌(49%可能性)；c，灰色奈瑟菌，脑膜炎奈瑟菌；d，芳香黄杆菌(鉴定值38.5%)，有毒威克斯菌(鉴定值28.3%)，短黄杆菌(鉴定值19.2%)。

注：横坐标，质/荷比(m/z);纵坐标,峰相对强度。

图3 部分实验菌株的MALDI-TOF MS峰

注：线段0.002代表0.2/100进化距离单位。

图4 基于16S rRNA基因序列和邻近连接法构建的系统发育树

2.5 药敏试验结果 10株实验菌株和蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015对庆大霉素MIC为0.5～1 μg/mL，四环素MIC为2～3 μg/mL，强力霉素MIC为1～3μg/mL，环丙沙星MIC为0.023～0.064 μg/mL，左氧氟沙星MIC为0.032～0.064 μg/mL，氯霉素MIC为2～8 μg/mL，参照CLSI M45-A2土拉弗朗西斯菌判读折点，对上述抗菌药物均敏感。

3 讨论

弗朗西斯菌是一种低GC含量的革兰阴性球杆菌，隶属于γ-变形菌纲的硫发菌目(Thiotrichales)。近年来研究发现，弗朗西斯菌广泛存在于自然界的水和潮湿的土壤环境中[8-9]，且能借助生物膜和原虫宿主的寄生作用，在外环境中长期存在。例如，在咸水环境中，蜃楼弗朗西斯菌和土拉弗朗西斯菌新凶手亚种，能以甲壳质酶依赖的方式在蟹壳、虾、软体动物、硅藻和浮游动物上形成生物被膜[10]，并通过伤口接触和溺水等方式引起人的感染。而在淡水环境中，土拉弗朗西斯菌可以长期存在于库蚊幼虫内，并在库蚊成年后，以叮咬的方式感染人类[11]。此外，在土耳其曾有饮用水源污染引起口咽部土拉菌病暴发的报道，并得到了包括全基因组测序在内的流行病学数据的支持[12]。然而，我国该类细菌的临床感染未引起人们的足够重视。本研究通过传统的形态学检验、生化反应、MALDI-TOF MS蛋白质指纹特征和16S rRNA基因测序的方法，最终将本课题组分离的10株临床和环境分离株鉴定为蜃楼弗朗西斯菌。并且发现10HL1950与现有的蜃楼弗朗西斯菌的生长特性具有典型的差异，且生境特殊，源于人工水体，不同于其他环境来源的咸水源菌株，故可能为一新的亚型。

就弗朗西斯菌和相关菌种的生物学特征来看，该类细菌的革兰染色特征典型，为革兰阴性球杆菌，且与沙黄的结合能力较弱，故革兰染色着色较淡(见图1)。此外，弗朗西斯菌的一些表型特征可与其他一些革兰阴性球菌和革兰阴性球杆菌相鉴别。例如，尿酶阴性，可与布鲁菌相鉴别[7]，在M-H平板和麦康凯平板不生长，可与不动杆菌相鉴别；V因子和X因子需求试验阴性，可与流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌相鉴别。蜃楼弗朗西斯菌对于营养要求不高，如采用Vitek 2 Compact GN卡和NH卡、API 20NE条和NH等鉴定系统，可能被错误鉴定为少动鞘氨醇单胞菌、灰色奈瑟菌、气味黄杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌和嗜沫嗜血杆菌等。其被错误鉴定的原因主要在于其临床报道较为少见，且不在上述细菌鉴定系统的数据库范围。另外，弗朗西斯菌的菌落表型可分为白色不透明、无色半透明型和灰色光滑型等类型。Gunn等[13]认为，光滑型菌落可能为野生型细菌，毒力和致病性更强，但由于受培养、传代及细胞壁脂多糖表达的影响，可能会在同一个平板出现两种不同的菌落表型，从而增加了对于其典型菌落的辨认难度。总的来说，对于革兰染色着色较淡的革兰阴性球杆菌，如尿酶阴性，在M-H平板和麦康凯平板不生长，V因子和X因子需求试验阴性，则应该高度怀疑为弗朗西斯菌，但确切的菌种鉴定还需依赖于分子生物学的技术和质谱鉴定的方法。

MALDI-TOF MS是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，具有快速、简便、可靠的特点[6]。从本课题组前期研究资料[3]来看，4 424 m/z存在于所有弗朗西斯菌属和另弗朗西斯属(Allofrancisella)的全部菌种中，可能是弗朗西斯菌科的“科”特征峰；5 180 m/z存在于已知弗朗西斯菌属的各个种之间，可能是弗朗西斯菌属“属”特征峰；而5 110 m/z可能是另弗朗西斯属的“属”特征峰[3]。并且，对于具有临床意义的生物恐怖菌——土拉弗朗西斯菌，特征峰6 141 m/z可用于其种的鉴定[5]。相信随着数据库的不断补充与应用软件的完善，MALDI-TOF-MS不仅将在弗朗西斯菌的鉴定中体现其快速、准确、灵敏的特点，还会成为弗朗西斯菌分型和流行病学研究的有力工具。

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(本文编辑：周万青，刘群)

Identification and characterization of 10Francisellaphilomiragiastrains

ZHANGLei1,YEDa-ning2,ZHUYan3,CHAIHai-yun1,ZHUQing-yi1,CHENCha4,QUPing-hua4
(1.MicrobiologyLaboratory,GuangzhouKingmedCenterforClinicalLaboratoryCompanyLimited,Guangzhou510330,Guangdong; 2.People′sHospitalofXinfengCounty,Xinfeng511100,Guangdong; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,QuanzhouMunicipalFirstHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Quanzhou362000,Fujian; 4.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofChineseMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,Guangdong,China)

Objectives To identify and characterize 10 strains ofFrancisellaphilomiragia-like organisms isolated from blood samples and environmental water. Methods The 10 clinical and environmental isolates were identified by traditional morphological examination and biochemical characterization, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry(MS) systems and sequencing based on 16S rRNA gene. The minimum inhibitory concentrations were tested by E-test methods. Results All the 10 isolates were gram-negative coccobacilli appearing tiny and faint counterstain of safranin, negative for urease, nitrate reduction and X and/or V factor requirement, but positive for oxidase and catalase. The isolates grew rapidly in sheep blood agar, chocolate agar and BCYE plate forming white opaque, colorless transparent or gray smooth colonies with about 2-mm diameters, but did not grow in M-H agar and MacConkey agar. The sequencing for 16S rRNA gene indicated that the 10 isolates shared more than 99.6% similarity toFrancisellaphilomiragia, and fell into the same clusters ofFrancisellaphilomiragiaon phylogenetic tree. The MALDI-TOF MS analysis also showed the typical peaks with 6 153 m/z, 5 180 m/z, 7 757 m/z and 9 392 m/z which were similar toFrancisellaphilomiragiaATCC 25015. However, they may be misidentified to beSphingomonaspaucimobilisby using Vitek 2 GN cards,Neisseriacinereaby using Vitek 2 NH cards,Myroidesodoratimimusby using API 20NE strips andHaemophilusby using API NH cards. The results of antimicrobial susceptibility showed that they were all sensitive to chloramphenicol, doxycycline, tetracycline, gentamicin, ofloxacin and ciprofloxacin. Conclusion The 10 isolates could be identified asFrancisellaphilomiragia, so we should pay more attention to the infrequent pathogen for its inactive biochemical reaction and the misidentification by commercial detection systems.

Francisellaphilomiragia; identification; MALDI-TOF MS

国家自然科学基金(31300004)。

张磊，1982年生，女，主管技师，主要从事临床微生物检验。

屈平华，副主任技师，硕士研究生导师，E-mail：ququtdr@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.09

R446.5

A

2017-02-20)