金菲，文怡，许雨乔，梅亚宁，夏文颖，王珏，倪芳(南京医科大学第一附属医院检验学部，南京 210029)

·微生物生物膜·

甜菜碱对金黄色葡萄球菌生物膜形成抑制与分散的作用*

金菲，文怡，许雨乔，梅亚宁，夏文颖，王珏，倪芳
(南京医科大学第一附属医院检验学部，南京 210029)

目的 研究金黄色葡萄球菌生物膜形成及甜菜碱对其抑制与分散的作用。方法 采用结晶紫染色法分别测定终浓度为1.0 g/L的甜菜碱对20株金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制能力和甜菜碱对金黄色葡萄球菌生物膜的分散能力。结果 20株金黄色葡萄球菌均能形成生物膜，其中甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)培养24 h时形成生物膜吸光度值(A590 nm)达峰值，为1.99±0.53；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)培养48 h时形成生物膜A590 nm达峰值，为1.13±0.47。加入甜菜碱共培养后，MSSA培养24 h后生物膜A590 nm为1.74±0.61，MRSA培养48 h后生物膜A590 nm为0.40±0.12，与对照组相比差异均有统计学意义(t值分别为2.43和5.84，P均<0.05)。当生物膜形成后加入甜菜碱，与对照组相比，MSSA和MRSA的生物膜A590 nm差异无统计学意义(P>0.05)。结论 1.0 g/L甜菜碱对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有良好的抑制作用，但不能分散已经形成的生物膜。

金黄色葡萄球菌；生物膜；甜菜碱

细菌生物膜(biofilm)是细菌为了适应生存环境而粘附在生物体或者非生物体表面，自身分泌细胞外基质，将细菌群包裹在内而形成，是区别于游离细菌的另一种常见生存模式。在自然条件下，生物膜形态占99%，人类感染疾病65%涉及细菌生物膜[1]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)常以生物膜形式致病，使患者发生慢性持续性感染[2]。甜菜碱(betaine)是一种季铵型水溶性生物碱，为无色或微棕色结晶的化合物，已被广泛应用于畜牧、医药、农林、食品和日化等领域，特别是在医药领域，人们相继发现甜菜碱具有许多优良的药理作用，但对细菌生物膜的抑制和分散作用未见报道。本文就甜菜碱在体外对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制和分散作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 19株临床分离的金黄色葡萄球菌均来自我院2016年5月至6月住院患者血培养标本，用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统对其鉴定。其中，10株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus, MSSA)，9株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)。MRSA判定采用CLSI推荐方法[3]。另有1株金黄色葡萄球菌标准株ATCC 25923。

1.2 主要试剂与仪器 结晶紫溶液：结晶紫饱和液(结晶紫2 g溶于100 mL 95%乙醇)20 mL+10 g/L草酸铵溶液(草酸铵10 g加温溶解于1 L蒸馏水)80 mL，混匀后用中速滤纸过滤后置于棕色瓶中备用。96%甜菜碱(南京明生医药技术有限公司)，无菌生理盐水稀释实验终浓度为1.0 g/L；Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统、DESICHECK比浊仪(法国生物梅里埃公司)；96孔细胞培养板(美国 Corning/Coster公司)；全自动恒温震荡仪SHA-B(金坛市国华仪器厂)；Thermo 自动酶联仪(美国Thermo公司)。

1.3 金黄色葡萄球菌生物膜模型建立 挑取金黄色葡萄球菌单个菌落于4 mL LB培养基中，35 ℃、120 r/min培养24 h，调整菌液浓度至0.5麦氏浊度单位。用LB培养液1∶100稀释上述菌悬液后，取100 μL加入96孔板中，再加100 μL LB培养液，以不加菌液的200 μL LB 培养液作空白对照，35 ℃静置培养24 h、48 h和72 h后分别检测生物膜。所有检测孔均设置3孔。

1.4 金黄色葡萄球菌生物膜成膜能力检测 采用结晶紫染色法，参照文献[4-5]进行。待生物膜形成之后，吸去96孔板内的培养液，加200 μL结晶紫溶液染色15 min，弃去染色液并用PBS冲洗3次洗去浮游细菌，待干后加200 μL 95%乙醇以溶解与细菌结合的结晶紫，用酶联仪测590 nm处吸光度(A590 nm)值。以空白对照孔平均吸光度值+3倍空白对照孔的标准差作为cut off值(Ac)。若实验组的A590 nm≤Ac，则成膜能力阴性；若A590 nm>Ac，则成膜能力阳性。

1.5 金黄色葡萄球菌生物膜抑制试验 0.5麦氏浊度单位的金黄色葡萄球菌菌悬液制备同1.3操作，用LB培养液1∶100稀释后每孔加100 μL，设3个复孔，同时每孔加2.0 g/L甜菜碱100 μL，以LB 培养液作空白对照，35 ℃静置培养24 h、48 h和72 h，采用结晶紫染色法检测细菌生物膜A590 nm。

1.6 金黄色葡萄球菌生物膜分散试验 0.5麦氏浊度单位的金黄色葡萄球菌菌悬液制备同1.3操作，用LB培养液1∶100稀释后每孔加100 μL，设3个复孔，以LB 培养液作空白对照，35 ℃静置培养24 h后(MRSA组静置48 h)，用PBS 清洗3 遍以去除浮游菌后每孔加1.0 g/L甜菜碱100 μL，35 ℃静置培养24 h、48 h和72 h，采用结晶紫染色法检测细菌生物膜A590 nm。

1.7 统计学分析 用SPSS 19.0软件进行。所有实验均设3个复孔取平均值，以均值±标准差表示，对照组与抑制组、分散组的统计学差异采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌成膜能力 19株金黄色葡萄球菌临床菌株和1株标准菌株均形成生物膜，但MSSA和MRSA成膜时间有差别。MSSA培养24 h时生物膜吸光度A590 nm值即达峰值，为1.90±0.53；48 h和72 h时分别为1.54±0.74、1.44±0.32。MRSA成膜时间较长，24 h时A590 nm值为0.41±0.11；48 h时吸光度A590 nm为1.13±0.47，达峰值；72 h时降为1.04±0.83。

2.2 甜菜碱对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用 在形成生物膜的过程中同时加入甜菜碱，MSSA组作用24 h、48 h和72 h时A590 nm值与对照组比较均显著性降低(t分别为2.43、4.03和3.34，P均<0.05)；MRSA组在48 h、72 h时A590 nm值与对照组比较也显著性降低(t分别为5.84和2.78，P均<0.05)。见表1。

表1 甜菜碱对MSSA、MRSA组生物膜形成(A590 nm)的作用

注：*，与对照组相比，P<0.05。

2.3 甜菜碱对金黄色葡萄球菌生物膜分散的作用 在形成生物膜后加入甜菜碱， MSSA组24 h、48 h和72 hA590 nm值与对照组24 h比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；MRSA组因在48 h形成生物膜峰值，故将甜菜碱24 h、48 h和72 h后与对照组48 h比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是临床常见的致病菌，据医院感染监控网数据显示，金葡菌在导致医院感染的革兰阳性菌中占第一位[6]。其中MRSA是临床抗感染治疗中比较棘手的多重耐药菌之一。即使是不携带耐药基因的金黄色葡萄球菌一旦形成生物膜，抗菌药物治疗效果也会大幅下降。本研究结果揭示，实验选取的19株临床菌株均形成生物膜，MSSA 24 h即形成生物膜，而MRSA稍慢，48 h生物膜形成达峰值。国外有研究认为，MRSA与MSSA生物膜形成机制不同， 胞间黏附素(intercellar adhesion, ica)依赖途径在MSSA生物膜形成中起重要作用，而MRSA生物膜形成主要由ica非依赖途径介导[7-8]。目前研究人员还不能明确MSSA和MRSA形成生物膜能力不同的原因。MSSA与MRSA在生物膜形成达峰值后，吸光度开始下降，这与其他研究一致[9],生物膜形成后由于深层的细菌很难获得养分和氧气，代谢产物难以排出而堆积，细菌进入衰减期。

甜菜碱是在甜菜中含量最多的生物碱，具有保肝护肾、抑瘤抗癌、降压镇静、解热镇痛等多种药理作用[10-11]。目前已有甜菜碱具有抑菌活性的报道[12]，其作用机制为带正电荷的N+吸附在表面带负电荷的细菌表面形成静电键，这种静电作用会使细胞壁的压力增大，然后长链烷基刺入细菌的细胞膜，使细菌的内容物外泄，同时还能使细胞壁上的蛋白质变性，降低蛋白质通道活性[13]。本研究通过甜菜碱对金黄色葡萄球菌生物膜形成抑制实验发现，对于MSSA，加入1.0 g/L甜菜碱作用24 h就能有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，MRSA加甜菜碱后48 h也有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成。本实验证实对已形成生物膜的MSSA和MRSA，0.1%甜菜碱均无法分散其生物膜。文献报道，中药对生物膜破坏作用呈剂量依赖性[9]，本实验所用甜菜碱浓度为1.0 g/L，分析原因，可能甜菜碱分散生物膜也依赖一定浓度与剂量，是否与1.0 g/L甜菜碱没有达到破坏金黄色葡萄球菌生物膜的浓度有关，后续将进一步研究不同浓度甜菜碱对金黄色葡萄球菌生物膜的分散作用。

本研究证实甜菜碱可以抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成，给临床感染治疗带来更多选择。但这些都只是基于体外研究，在体内情况如何及其作用机制有待进一步研究。

[1]佘鹏飞，王央霞，陈丽华，等. D-酪氨酸与3，3′-二氨基二丙基胺对多重耐药鲍曼不动杆菌生物膜形成与分散的影响[J].临床检验杂志,2015,33(6):460-463.

[2]Smith K，Perez A，Ramage G,etal． Biofilm formation by Scottish clinical isolates ofStaphylococcusaureus[J].J Med Microbiol，2008,57(Pt8): 1018-1023.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing,CLSI documents M100-S23 [S]. Twenty-Fourth Informational Supplement. Wayne,PA: CLSI,2013.

[4]Hassan A, Usman J, Kaleem F,etal. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates [J]. Braz J Infect Dis,2011,15(4): 305-311.

[5]卢鸿,张亚培,毕文姿,等. 广泛耐药肺炎克雷伯菌生物膜形成能力及毒力基因相关分析[J]. 临床检验杂志,2016,34(6):436-439.

[6]蒋程，吕健刚，辛传伟，等.2011-2014 年革兰阳性菌的分布及耐药性变迁研究[J]. 中国现代应用药学,2016 33(4):473-476.

[7]O′Neill E,Pozzi C,Houston P,etal.Association between methicillin susceptibility and biofilm regulation inStaphylococcusaureus isolates from device-related infections [J]．J Clin Microbiol, 2007,45(5):1379-1388．

[8]O′Neill E,Pozzi C, Houston P,etal.A novelStaphylococcusaureus biofilm phenotype mediated by the fibronectin-binding proteins,FnBPA and FnBPB [J].J Bacteriol,2008,190(11):3835-3850．

[9]李将,刘广锋,李瑶,等.金黄色葡萄球菌生物膜形成规律及清开灵颗粒对其影响研究[J].广东药学院学报,2015,31(1):114-116.

[10]李炳龙，齐永秀，刘常丽，等．甜菜碱药理作用机制及其药效学研究进展[J]．中国新药杂志，2008，17(18): 1571-1574．

[11]李炜，张丹参．甜菜碱的提取分离及测定方法的研究进展[J]．医学综述，2006，12(8): 506-507．

[12]张爱君，张彩芳，王秀青，等. 甜菜碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抑菌效果的实验研究[J]. 宁夏医学杂志,2012,34(12):1219-1220.

[13]刘珏玲，杨伟峰，王毅. 细菌生物膜与表面活性剂抗菌的研究进展[J]. 中国病原微生物学杂志, 2016,11(9):858-860.

(本文编辑：刘群)

Inhibitory and dispersive effects of betaine on formation ofStaphylococcusaureusbiofilm

JINFei,WENYi,XUYu-qiao,MEIYa-ning,XIAWen-ying,WANGJue,NIFang
(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalMedicalUniversity,Nanjing210029,Jiangsu,China)

Objective To observe the formation ofStaphylococcusaureusbiofilm and the inhibitory and dispersive effects of betaine on the biofilm. Methods The inhibitory and dispersive effects of 0.1% betaine on the biofilm from 20 strains ofStaphylococcusaureuswere examined by crystal violet assay. Results All the 20 strains ofStaphylococcusaureusformed biofilm. The biofilm of methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus(MSSA) was formed in 24 hours with peak value of absorbance(A590 nm)(1.99±0.53). The biofilm of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) was formed in 48 hours with peak value of absorbance(A590 nm)(1.13±0.47). After adding betaine, the absorbance(A590 nm) of MSSA biofilm fell down to(1.74±0.61) in 24 hours, while the absorbance(A590 nm) of MRSA biofilm fell down to(0.40±0.12) in 48 hours, which was significantly reduced compared with the controls(t=2.43, 5.84,P<0.05 respectively). When adding betaine after the biofilm formed, the absorbancies(A590 nm) of both MSSA and MRSA showed no significant difference compared with the controls(P>0.05). Conclusion Betaine could inhibit biofilm formation ofStaphylococcusaureusat concentration of 0.1%, but it could not disperse the mature biofilm ofStaphylococcusaureus.

Staphylococcusaureus; biofilm; betaine

江苏省实验诊断学重点实验室基金(xk201114)；南京医科大学“十二五”教育研究课题(JYK2015020)。

金菲，1987年生，女，大学本科，从事临床微生物专业工作。

倪芳，主任技师，E-mail:yunerni@163.com；王珏，主管技师，E-mail:13852299659@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.06

R446.5

A

2017-02-01)