郑欣+刘夏囡+郑胜男+车轩+周士钊+迟世飞+邢伟+付童童+孙川惠+赵凤云

摘要：以DR5-GUS转基因水稻 （以水稻中花11为背景）为试验材料，分析镉胁迫下超氧阴离子（O-2· ）介导的根系生长动态变化与生长素重新分布之间的关系。结果发现，在镉胁迫与非胁迫条件下DDC（SOD抑制剂）处理明显促进了根系的生长。GUS活性检测显示DDC和Cd+DDC处理条件下根系生长的动态变化与生长素浓度和分布的动态变化密切相关。进一步研究显示，DDC+BFA（蛋白运输抑制剂）/MG132 /（蛋白降解抑制剂）或Cd+DDC+BFA/MG132处理比DDC或Cd+DDC处理增强了GUS活性。這些结果证实O-2· 介导的生长素重新分布与蛋白转运/降解有密切关系，O-2· 与生长素信号之间存在交互作用。以上结果表明，适量的O-2· 通过蛋白转运/降解介导的生长素重新分布是镉胁迫及非胁迫条件下水稻幼苗根系生长特别是不定根和侧根生长所必需的。

关键词：生长素分布；镉胁迫；水稻根系；超氧阴离子

中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0055-04

水稻根系是吸收水分和营养的主要器官，根系的结构受内部遗传因子和外界环境条件的共同调节[1]。生长素是调节植物根系生长发育的关键激素之一，如添加外源生长素促进侧根的形成，而使用生长素运输抑制剂则抑制根的生长[2-3]。研究表明，生长素信号是水稻不定根形成所必需的[4]。高浓度氮对玉米根生长的抑制作用与其降低根系内生长素（IAA）水平有关[5]。各种环境因子和内部信号调节生长素的运输和极性分布，进而影响植物根系的生长发育[6-7]。如低温影响拟南芥生长素运输，从而抑制根系生长[8]；镉 （Cd）胁迫条件下拟南芥根内生长素的分布与其侧根的形成密切关联[9]；在铝和铜胁迫植物中根系结构的变化也与生长素重新分布有关[3，10]。近来研究发现，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是调节植物根系生长发育的重要信号分子之一[11-12]。如在非胁迫条件下ROS是调节玉米和水稻根系生长所必需的[13-14]，前期研究也表明 0.1 mmol/L Cd 处理下O-2· 和H2O2参与了水稻根系生长发育的调控[15-16]，但是Cd胁迫下根系生长和生长素分布的动态变化与O-2· 之间的关系还不清楚。Cd是主要的环境污染物，低浓度促进根系生长，高浓度则抑制生长。本试验进一步研究 0.1 mmol/L Cd 处理条件下根系生长和生长素分布的动态变化与O-2· 之间的关系，旨在为更好地了解Cd胁迫影响植物生长发育的机制奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与处理

DR5-GUS 转基因水稻种子（中花 11 为背景，DR5-GUS 报告基因广泛用于生长素研究）预萌发3 d后分别转入含0.1 mmol/L Cd（NO3）2、3 mmol/L DDC （SOD 抑制剂） 和0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC的固体MS 培养基上，在培养箱内[光照度200 μmol/（m2·s） 、14 h光照、昼/夜温度27 ℃/21 ℃和相对湿度60%/80%]培养5～9 d，然后进行数据统计分析。每种处理至少重复3次。

1.2根系生长统计

初生根和不定根长度用尺子测量，侧根数量和长度在解剖镜下统计，每个处理至少用60株幼苗，数据用每株的平均值表示。

1.3O-2· 的测定

上述幼苗处理 9 d后用NBT法[17] 检测根尖上O-2· 的积累与分布，每种处理至少用 60个根尖，解剖镜拍照。

1.4根系GUS活性组织化学分析

DR5-GUS转基因水稻种子预萌发3 d后分别转入含01 mmol/LCd（NO3）2、3 mmol/L DDC和0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC的固体MS培养基上，在上述条件下培养3～7 d，然后进行GUS活性检测[18]。为进一步分析 O-2· 与蛋白转运和降解的关系，DR5-GUS 转基因水稻种子在MS培养基上萌发生长7 d后转入Hoagland营养液，分别用50 μmol/L BFA （蛋白转运抑制剂）或50 μmol/L MG132 （蛋白降解抑制剂） 处理 3 h，再转入新的Hoagland 营养液分别加入3 mmol/L DDC 或0.1 mmol/L Cd（NO3）2+3 mmol/L DDC 处理24 h（培养条件同上），取根系进行GUS染色，解剖镜拍照。每种处理至少用15株。1.5数据统计分析

用SPSS 16.0软件对不同处理数据进行统计分析，P<005为差异显著，试验结果用3次独立重复的平均值±标准差来表示。

2结果与分析

2.1不同处理对根尖O-2· 积累的影响

与对照相比，Cd、DDC和Cd +DDC处理增加了O-2· 在初生根根尖的积累，而且Cd+DDC处理的根尖O-2· 产生量比单一Cd或DDC处理的多。在每种处理中O-2· 主要集中在分生区和伸长区，不定根中O-2· 的积累与分布变化与初生根的类似（图1）。

2.2Cd胁迫下O-2· 对初生根生长的影响

Cd、DDC和Cd+DDC处理5～9 d后初生根生长的动态变化存在差异（图2）。在5～9 d处理期间Cd+DDC比其他处理显著促进了初生根的生长，与对照比，Cd处理7 d促进生长，而DDC处理9 d时才有明显的促进作用。

2.3Cd胁迫下O-2· 对不定根生长的影响

在5～9 d处理期间，DDC和Cd+DDC明显加快了不定根的形成和伸长生长（P<0.05），而Cd 处理7 d时不定根的数量和长度才明显增加（图3）。

2.4Cd胁迫下O-2· 对侧根生长的影响

Cd+DDC处理5～9 d后侧根总数明显比其他处理的多（P<0.01），而在DDC 处理中这种促进作用发生在处理后9 d（P<0.05，图4-a）。与对照比，Cd+DDC处理5～9 d后侧根总长度明显增加（P<0.01，图4-b），而DDC处理7 d时这种促进作用特别显著（P<0.01）。这些结果表明O-2· 参与了水稻根系生长发育的调节，而且这种促进作用与其水平有关。在Cd、DDC和Cd+DDC处理条件下初生根、不定根、侧根生长的动态变化有明显差异。

2.5Cd胁迫下O-2· 介导的水稻根系生长动态变化与生长素重新分布有关

为进一步了解Cd胁迫下O-2· 介导的根系生长动态变化与生长素时空分布之间的关系，以DR5-GUS转基因水稻幼苗为材料，测定不同处理3～7 d期间根系GUS活性的变化（图5）。不同处理3 d时，根内GUS的表达方式类似，GUS染色主要在初生根的前端（图5-A）。DDC和Cd+DDC处理 5 d 时，GUS的表达方式发生了变化，GUS染色主要集中在不定根和侧根，生长素分布的变化与这些根的快速增加和伸长生长密切关联（图5-B）。但是对照和Cd处理的根GUS的表达方式变化不明显，不定根和侧根的产生也比较少。Cd处理7 d时，GUS染色在不定根和侧根丰富，此时DDC和Cd+DDC处理整个根系GUS活性则比Cd处理的低（图5-C）。试验结果表明，生长素分布的动态变化与根系生长的动态变化有密切关系，DDC和Cd+DDC处理加快了生长素的重新分布和不定根与侧根的生长；无论在Cd胁迫还是非胁迫条件下O-2· 对根系生长的调节与其调控生长素的重新分布有关。

2.6Cd脅迫下O-2· 介导的生长素分布与蛋白转运和降解有关

生长素分布是生长素合成和运输共同作用的结果。OsPIN 是生长素极性运输蛋白，BFA抑制OsPIN蛋白从内质网向细胞膜的运输，进而影响生长素的转运。生长素合成与蛋白代谢有关，MG132抑制蛋白降解，从而介导生长素的分布。DDC+BFA处理24 h，初生根和不定根GUS活性比单一DDC处理的强；同样，Cd+DDC+BFA处理的GUS活性也比Cd+DDC处理的强（图6），表明O-2· 调节的生长素重新分布与蛋白转运有关。DDC+MG132处理的根GUS活性比DDC处理的强，与此类似，Cd+DDC+MG132处理的根GUS活性也比Cd+DDC处理的高（图6），说明O-2· 介导的生长素重新分布与蛋白降解有密切关系。

3讨论与结论

越来越多的研究表明，ROS是调节植物根系生长发育的重要信号分子[12-13]。前期研究显示，在分子水平上O-2· 影响生长素和细胞周期基因的表达[15]。本研究中不同处理条件下初生根、不定根、侧根生长的动态变化与O-2· 水平有密切关系。在Cd胁迫和非胁迫条件下，较高的O-2· 促进不定根和侧根的生长发育，特别是在幼苗生长早期（5～7 d）这种促进作用更明显（图1至图5）。这些结果说明 O-2· 在水稻根系生长过程中有重要的调节作用。值得注意的是，在幼苗生长早期适量的O-2· 促进根系的快速生长对植物在胁迫条件下的生存至关重要。研究发现，生长素运输是水稻不定根形成所必需的[4]，本研究中DDC和Cd+DDC处理5 d时显著促进了不定根的形成和生长，说明O-2· 在这一过程中可能影响了生长素运输（图2、图5）。生长素分布的动态变化调节植物生长发育的众多过程。本研究中根系生长的动态变化与生长素分布的动态变化密切关联，较高水平的O-2· （DDC和Cd+DDC处理）加快了生长素的重新分布，促进了不定根和侧根的快速生长（图5）。生长素的局部浓度是生长素合成和转运共同作用的结果，与蛋白转运和代谢有关。本研究中DDC+BFA/MG132和Cd+DDC+BFA/ MG132处理的根中GUS活性明显高于DDC和Cd+DDC处理的根，这些结果证实O-2· 介导的生长素重新分布与蛋白转运和降解有密切关系。O-2· 与生长素信号存在交互作用，本试验条件下O-2· 可能在生长素信号传导途径的上游发挥作用，因为O-2· 影响生长素的分布，但不能排除 O-2· 通过其他途径调节水稻根系的生长和生长素分布。

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