杜英侠++任浩杰++张菊林++付晚涛

摘要 本文用5种分离培养基从大连海域潮间带采集的2种海绵中分离培养放线菌，以副溶血弧菌、哈维弧菌和鳗弧菌3种海水养殖病原菌为指示菌对放线菌进行抑菌活性的筛选，并基于16S rDNA序列对筛选出的抑菌活性较强的海绵放线菌进行多样性分析。结果表明：从海绵中共分离出57株海绵放线菌，以寡营养的M2培养基分离效果最好。抑菌活性筛选有55株对3株指示菌中的至少1株具有抑菌活性；有11株抑菌活性较强，对3株指示菌均具有抑菌活性，初步鉴定均属于链霉菌属。由此表明，海绵放线菌多能够产生对海水养殖病原菌较强的抑菌活性，是天然活性物质的重要来源，在海水养殖应用方面具有较大的开发价值。

关键词 海绵放线菌；抑制弧菌；抑菌活性；多样性分析

中图分类号 Q939.13 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07-0229-03

Isolation of Sponge-associated Actinobacteria and Its Antibacterial Activity Screening

DU Ying-xia 1 REN Hao-jie 1 ZHANG Ju-lin 2 FU Wan-tao 2，3 *

（1 College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian Liaoning 116023； 2 College of Marine Science-Technology and Environment，Dalian Ocean University； 3 Key Laboratory of Nearshore Marine Environmental Science and Technology of Liaoning Province′s University）

Abstract This text isolated actinomycetes from 2 kinds of sponge taken from Dalian ocean intertidal zone with 5 kinds of separation medium.The antibacterial activity of sponge-associated actinobacteria was screened with Vibrio parahaemolyticus，Vibrio harveyi and Vibrio anguillarum as indicator bacteria.The diversity analysis of sponge-associated actinobacteria with strong antibacterial activity was conducted based on 16S rDNA sequence.The study showed that 57 strains in total were isolated from the sponges，and the separation effect of oligo-culture M2 was the best.The result of antibacterial activity screening found that 55 strains had antibacterial effect on at least one of the 3 indicator bacteria.There were 11 strains preliminarily identified as Streptomyces sp. having stronger antibacterial effect on all the 3 indicator bacteria.The results showed that most of the sponge-associated actinobacteria which was an important source of bioactive natural products had quite strong inhibition on mariculture pathogen.It has a great development value in the field of mariculture.

Key words sponge-associated actinobacteria；inhibition of vibrio；antibacterial activity；diversity analysis

随着陆源微生物资源的开发难度越来越大，海洋丰富的微生物资源愈发受到人們的广泛重视。海洋放线菌因为生存环境的特殊性，能够产生结构新颖、抑菌活性显著的次级代谢产物[1]。海绵是海洋放线菌最重要的一种共附生生物，其体内的微生物可高达海绵生物量的50%～60%[2-3]，因而是目前寻找新型天然活性化合物的重要途径之一。近年来，已有不少学者从海绵中分离获得具有强抑菌活性的放线菌菌株，在产生抗细菌、真菌等活性物质上具有较大的潜能[4-7]。

我国作为水产养殖大国，随着海水养殖行业的繁荣发展，由弧菌引起的水产病害仍是人们治疗防范的重点。本研究从海绵中分离筛选出3种常见的海水弧菌，即副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈维弧菌（Vibrio harveyi）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum），三者均属于具有抑制作用的放线菌。本文通过16S rDNA序列对具有较强抑菌活性的海绵放线菌进行分子鉴定，旨在发现具有海水养殖应用价值的海洋放线菌。

1 材料與方法

1.1 试验材料

1.1.1 海绵样品。繁茂膜海绵（Hymeniacidon perlevis）、软海绵属海绵（Halichondria sp.）均采自大连黑石礁海域潮间带，30 min内迅速带回实验室。

1.1.2 分离培养基。①M2培养基：甘油6 mL，精氨酸1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 L，pH值自然。②M2′培养基：甘油0.6 mL，精氨酸 0.1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 L，pH值自然。③M8′培养基：酪蛋白胨0.02 g，天冬氨酸0.01 g，丙酸铵4 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 L，pH值7.0。④RH培养基：棉籽糖1 g，组氨酸0.25 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 L，pH值7.0。⑤GT培养基：甘露糖1 g，胱氨酸0.25 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CaCO3 0.05 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 L，pH值7.0。

1.1.3 指示菌。副溶血弧菌、哈维弧菌和鳗弧菌均来自大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 海绵放线菌的分离。用无菌海水浸洗海绵5遍，除去表面附着的杂质物，再用无菌研钵研磨成浆，加入无菌海水稀释10倍[8]后，取100 μL研磨液在不同的分离培养基上进行平板涂布，于28 ℃培养箱中倒置培养。培养基中均分别加入15 mg/L萘啶酮酸和50 mg/L重铬酸钾[9]抑制细菌和真菌的生长。

1.2.2 具有抑菌活性的海绵放线菌筛选。将分离纯化的放线菌在改良高氏一号培养基[8]上28 ℃培养8～10 d至成熟，采用琼脂块法[10]进行抑菌活性筛选。用无菌打孔器（直径10 mm）在长满放线菌的平板上打孔，将琼脂块菌面向下分别置于涂布3种指示菌的营养琼脂培养基平板上，30 ℃培养24 h，观察抑菌结果。

1.2.3 具有抑菌活性的海绵放线菌的多样性。以抑菌圈直径（ID）大小为判断海绵放线菌抑菌活性强弱的指标，对筛选出的抑菌活性较强（ID≥15 mm）的海绵放线菌进行分子鉴定。将海绵放线菌单菌落接入装有5 mL灭菌 ISP2液体培养基的15 mL试管中，于30 ℃恒温振荡培养2～3 d。收集1 mL培养液，按照TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 试剂盒说明提取放线菌基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，参照信艳娟等[9]的引物F8/R1492的PCR反应条件扩增16S rDNA片段。扩增产物送至上海生工进行测序，测序结果在NCBI 的GenBank 进行Blast 比对，利用MEGA 5.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 海绵放线菌的分离

利用5种分离培养基从海绵中共分离出57株放线菌，并且选用不同培养基对海绵放线菌的分离效果差别很大[10] 。

由图1可以看出，分离效果较好的培养基有M2、RH和GT，其中M2培养基中共分离得到22株放线菌，分离效果最好。有研究发现，在培养基中加入低比例的营养成分能分离出更多的海洋特有放线菌[11]。M2培养基中除甘油和精氨酸外，仅提供了简单的K、P和Mg等无机盐，适合海绵放线菌的分离，这与很多研究发现甘油-精氨酸培养基的分离效果较好相符[12-14]；RH和GT培养基除提供了唯一的碳源和氮源外，其中加入的一些无机离子成分作为无机营养盐，都是成分简单的寡营养培养基，满足了海绵放线菌的特殊需求。

2.2 具有抑菌活性的海绵放线菌筛选

以抑菌圈直径大小为海绵放线菌抑菌活性强弱的判断指标，其结果见表1。可以看出，从中筛选出11株活性较强（对3株指示菌均具有抑菌效果，且至少对1株指示菌的抑菌圈直径ID≥15 mm）的海绵放线菌。分离出的57株海绵放线菌中有55株对3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，表明海洋放线菌广泛的抑菌活性具有无限的开发潜能，值得人们关注研究。

2.3 具有抑菌活性的海绵放线菌的多样性

对筛选出的11株抑菌活性较强的海绵放线菌进行16S rDNA序列分析，利用MEGA 5.0软件对这些序列进行分析，采用邻接法，重复取样1 000次，构建的系统进化树如图2所示。可以看出，筛选出的这11株海绵放线菌均属于链霉菌属的不同种，对3种指示菌均具有抑菌活性，展现出海绵放线菌的多样性。

3 讨论

海绵是一种简单而古老的多细胞动物，能产生比其他海洋生物物种更为丰富的生物活性物质，是海洋天然产物的重要来源。其体内大量的微生物资源得到分离并成功培养的占整个海绵微生物群落的不足0.1%[15]。对于海绵放线菌的分离培养，仍需要更积极地探索。其中，选择性分离培养基的成分对于海洋放线菌的分离具有重要影响。研究发现，营养简单的培养基更适合放线菌的分离[8]。常显波等[16]用9种分离培养基对青岛海区潮间带的沉积物进行放线菌分离，培养基M1、M6分离得到的放线菌数目较多，主要碳源为可溶性淀粉和棉籽糖，是放线菌的偏好营养成分[17]。M8含有放线菌喜好的精氨酸和甘油成分[18-20]，分离到的数量也较多，与本文中M2培养基分离效果最好一致，低营养的RH和GT培养基同样分离效果较好。

采用琼脂块法筛选海绵放线菌抑菌活性，海绵放线菌展现出较好的抑菌活性，在分离出的57株放线菌中有55株对3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，仅有2株未表现出抑菌活性，说明海绵放线菌在开发抑菌活性物质上有广阔的前景。由于本文中指示菌的广谱性不高，或者受分离方法的限制，对于未表现出抑菌活性的海绵放线菌并不能判定无活性，需要针对不同的指示菌或者采用不同的筛选方法进一步的筛选验证。

本研究中，从57株海绵放线菌中筛选出11株抑菌活性较强的海绵放线菌，对3株海水养殖病原指示菌均有抑制作用，且对至少1株指示菌产生的抑菌圈直径>15 mm，值得进一步进行抑制海水养殖弧菌的生物活性等方面的研究。李 侠等[21]从山东日照海域潮间带分离筛选出4株对半滑舌鳎鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和副溶血弧菌（Vibrio paraha-emolyticus）同时具有较强拮抗作用的海洋放线菌，基本满足海水养殖弧菌病防治要求。海洋放线菌对海水养殖病原菌具有较强的抑制作用，在海水养殖病害防治方面具有潜在的应用价值。

放线菌以产生丰富的次级活性代谢产物而著称，特别是链霉菌属作为已知放线菌中最大的族群，是产生抗生素最多的种属[22]，受到人们的高度重视。本文对筛选出的11株抑菌活性较强的海绵放线菌进行了16S rDNA序列分析，初步鉴定均属于链霉菌属，进一步说明海洋链霉菌是获得活性代谢产物的重要资源。

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