刘文斌+曹广文

摘要：化疗耐药是当前肝癌治疗的主要问题。ATP结合盒（ABC）转运体家族通过诱导肿瘤细胞药物外排导致耐药。ABCB1是介导肝癌耐药的主要ABC转运体亚型，其表达与肝癌细胞的干性特征相关。炎症和癌症相关的多种信号通路关键分子协同调节了ABC转运体的表达。维拉帕米可以通过抑制ABCB1功能而逆转肝癌的耐药性。对于ABC转运体和肝癌耐药性的深入研究可以进一步完善癌症治疗策略，降低患者死亡率。

关键词：肝癌；耐药；ATP结合盒转运体；维拉帕米

1 肝癌的化疗耐药

我国是肝癌大国，肝癌患者数量和相关死亡人数均占世界总数的50% [1]。肝癌的恶性程度高、预后较差，发病率和死亡率的比值接近1：1 [1]。目前原发性肝癌的治疗分为根治性策略（射频消融术、肝部分切除术、肝移植术）和姑息性治疗策略（化学栓塞疗法、索拉非尼靶向治疗）两类。循证医学研究证实，巴塞罗那临床肝癌分期（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）的早期患者（BCLC-0和BCLC-A）可以接受根治性療法，但中晚期患者（BCLC-B和BCLC-C）接受根治性手术的收益不显著，选择姑息性治疗策略可以明显延长生存时间 [2]。但大部分患者在确诊时已经处于中晚期，严格满足国际推荐手术指征的患者仅有10% [3]，部分患者需进行辅助化疗后才能获得手术治疗机会[9]。同时，HCC切除术后的复发率较高，国际数据显示50%的患者在术后2年内复发，75%的患者在术后5年内复发，术后化疗是防治复发的重要措施 [4]。因此，经典抗肿瘤化学药物和靶向药物治疗是延长绝大多数手术和非手术肝癌患者生存时间的主要手段。然而，当前的肝癌化疗效果仍严重受到肿瘤耐药性的限制。临床随机对照研究的荟萃分析显示，标准化疗药物在肝癌中的反应率仅有50%左右 [3]。索拉非尼是目前唯一由美国食品药品安全管理局批准使用的肝癌靶向治疗药物，对患者生存期的延长也仅有3个月 [3]。基于我国社区人群的10年癌症数据统计证实，肝癌患者的术后5年生存率仅为32.64% [5]。肿瘤的耐药性可以分为2种：一是针对曾经接触过的药物，产生特异性的耐药机制；二是对多种化学组成并不相似、肿瘤细胞也从未接触过的药物产生抵抗，称为多药物抵抗[l1]（multi-drug resistance，MDR）。单一药物的耐药机制多样，比如靶蛋白改变、药物代谢增加等，解决方法也相应更为困难。而MDR的机制则较为单一，是由ATP结合盒（ATP binding cassette，ABC）转运体家族将药物“外泵”，进而减少肿瘤细胞内药物积累导致 [6]。

2 ABC转运体诱导肝癌耐药

2.1 ABC转运体家族及基本结构功能

ABC转运体家族分为7个亚型（A-G）共48种分子。其中发现最早、被证明与人类肿瘤耐药性联系最紧密的是B1亚型（ABCB1），称多药物抵抗蛋白1（MDR1）或P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）。ABCB1也是目前蛋白质结构和功能最为明确的分子。该蛋白由4个功能性结构域组成：2个核甘酸结合结构域（nucleotide-binding domains，NBDs）以及2个跨膜螺旋结构域（transmembrane helice domains，TMDs），每个TMD包含6个跨膜螺旋。NBDs位于细胞内，通过水解ATP为ABCB1/MDR1/Pgp转运底物分子提供能量。TMDs组成可闭合的通道结构，当疏水性的底物分子进入细胞脂质双分子层的中间，尚未进入细胞质时，即可与TMDs结合并被“泵出” [7]。ABCB1/MDR1/Pgp的底物识别结构域很多，12个跨膜螺旋均含有底物结合位点，不同结合位点在空间位置上较为紧密，但识别和结合的药理结构并不相同，因此可以同时诱发多种药物的耐药现象。肝癌细胞中的研究发现，该蛋白不仅在细胞膜上分布并增加药物的外排，同时还分布在细胞囊泡和溶酶体表面，阻碍了进入细胞的药物被隔离分解，从而增加肝癌耐药性 [8]。其余ABC转运体家族的结构与ABCB1相似，只是NBDs和TMDs数量有差异。ABC转运体家族诱导的药物抵抗种类广泛。一项药物基因组学研究利用包括肝癌细胞在内的60种细胞系进行了所有ABC转运体亚型的mRNA表达水平检测；结合这些细胞已经进行的药物筛选数据，该研究发现共有1429种药物的肿瘤敏感性与ABC转运体的表达成负相关 [9]。

2.2 ABC转运体表达与肝癌细胞耐药

细胞和动物模型研究中已经明确与肝癌相关的亚型是ABCB1/MDR1/Pgp [10]。该亚型可以主动转运的肿瘤化疗药物种类最多，包括经典的细胞毒药物，如蒽环类（柔红霉素、多柔比星、表阿霉素）、蒽类（比生群、米托蒽醌）、生物碱类（长春碱、长春新碱、喜树碱）和微管蛋白聚合抑制剂（紫杉醇、秋水仙素、多西他赛）以及新一代靶向药物，如伊马替尼、厄洛替尼和舒尼替尼等 [9]。使用上述药物选择出的耐药细胞株中ABCB1/MDR1/Pgp均显著高表达 [11]。

耐药细胞株的构建维持需要药物持续刺激。值得注意的是，在药物刺激后期，耐药细胞株会还会高表达ABCB1/MDR1/Pgp以外的家族类似物，比如ABCA2、ABCC1、ABCC2、ABCC4和ABCG2。同时，一些ABC转运体亚型从未发现在耐药细胞系中高表达，但转染正常细胞后同样可以导致MDR，比如ABCB11、ABCC3、ABCC5、ABCC6、ABCC10和ABCC11 [9]。虽然上述研究并不都是在肝癌细胞模型下完成，但也提示实际肝组织中的MDR可能并不是ABCB1/MDR1/Pgp单独作用的结果，而且长期药物压力选择下，主要驱动MDR现象的ABC转运体亚型也会出现改变。

2.3 ABC转运体是肝癌干细胞的标志性分子

ABCB1/MDR1/Pgp 及其家族类似物的表达水平不仅诱导了肿瘤耐药，还促进了侵袭、增殖和低分化等恶性表型。未治疗过的原发性HCC组织中ABCB1/MDR1/Pgp显著高表达，而且与分化水平、癌症分级、肿瘤大小、血管侵袭、淋巴节转移以及预后相关 [12]。同时，ABCB1/MDR1/Pgp也在肝祖细胞和CD434+肝干细胞中高表达，含有致癌性突变K7/K19的肝祖细胞中还同时高表达ABCC1和ABCG2 [12] [13]。ABCC1与前列腺癌、肺癌和乳腺癌化疗耐药有关，ABCG2则与乳腺癌和白血病的耐药性有关 [13]。机制研究发现，ABCB1/MDR1/Pgp可以激活抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL以抑制正常细胞和癌症细胞对凋亡信号的反应，使用ABCB1/MDR1/Pgp抗体可以逆转这一作用 [13]。ABC相关的遗传多态性也促进了肝癌的发生风险，比如基于北欧人群的全基因组分析发现ABCB4上的单碱基突变与肝脏疾病的发生有关 [14]。因此可以推测，除了直接诱导药物外排，ABCB1/MDR1/Pgp作为肿瘤干性分子，还在化疗后促进新的肝癌干细胞亚型增殖形成再发肿瘤。

2.4 ABC转运体的药物代谢功能

ABC转运体是进化十分保守的分子，其“外泵”作用不仅与肿瘤耐药性有关，也维持了细胞自身的稳态，参与了多种正常的生理功能，包括化合物的经肠道外排和肝肾代谢 [9]。正常情况下，该蛋白在全身各组织中低剂量表达，但会显著集中在个别器官，比如肝小管周围的肝细胞、肾小管细胞和肠道细胞。这些组织细胞的ABC转运体通过向体外分泌化合物，加速药物外排，降低血药浓度和体液环境中的药物浓度，影响化疗效果。ABCB1/MDR1/Pgp敲除小鼠的口服药物血液浓度要高于正常小鼠；联合使用ABCB1/MDR1/Pgp抑制剂可以提高口服药的生物有效率 [15]。意大利人群研究发现，ABCB11和ABCB4的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）低频基因型会导致这两种基因的表达沉默，其上游调控通路MAPK和JNK通路的扩增突变也会抑制ABCB11和ABCB4的表达，进而阻碍胆汁酸盐的外排，引发肝细胞的慢性炎症，增加肝癌的发生风险 [16]。

2.5 ABC转运体表达的调节

ABC转运体的转录调控因子和表观遗传修饰位点众多。ABCB1基因的启动子无典型的“TATA盒”序列，而是以启动元件（initiator，Inr）控制。多种转录因子结合位点重叠分布在Inr前的启动子区域，主要可以分为3类：结合颠倒CCAAT盒（“Y”盒）的NF-Y和YB-1蛋白，结合CAAT盒的c-fos和NF-κB蛋白，以及结合GC盒的Sp1-3、EGR1和WT1蛋白 [9]。以Sp1-3与NF-Y为主，可以组成“MDR1增强子”元件，富集组蛋白乙酰化酶P/CAF，进而乙酰化近ABCB1启动子的组蛋白，提高ABCB1的转录水平 [17]。与之相对应的是，甲基化DNA结合蛋白MeCP2可以识别并结合ABCB1启动子上的甲基化位点，并富集组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），使最近的组蛋白构象趋于紧密，进而抑制ABCB1转录 [18]。

ABC转运体的表达是应激反应、炎症和癌症信号通路协同作用的结果。利用化合物诱导的小鼠肝脏炎症模型中发现，IL-6可以激活CAAT增强子结合蛋白（C/EBPb）进而增强小鼠ABCB1基因的转录；糖皮质激素可以刺激仓鼠C/EBPb的同源受体，达到类似的效果 [19] 。ABCB1基因近段启动子可以被p53调节，野生型p53可以抑制ABCB1转录，而突变型p53及p53家族的两个亚型（p63和p73）则可以激活ABCB1转录，野生型和突变型p53结合的具体位点也不相同 [9]。人类腺病毒感染肺癌细胞会诱导ABCB1/MDR1/Pgp表达增高 [20]，乙肝病毒感染是否会有相似的作用尚不明确。

3 ABC转运体抑制剂及其肝癌治疗价值

ABC转运体抑制剂的主要作用机理是结合TMD上的药物识别位点，进而阻碍其“外泵”功能。奎宁、硝苯地平、利福平和维拉帕米等药物均可以抑制ABCB1/MDR1/Pgp功能。其中，维拉帕米可以识别并结合的位点最多，因此逆转肿瘤耐药性的能力最突出 [7]。这最早在乳腺癌和卵巢癌的队列研究中得到了验证 [9， [21]。限制维拉帕米临床应用的是其钙通道抑制作用引发的心血管系统不良反应。体外实验证明，维拉帕米浓度在6-10mol/L（2.94-4.91g/mL）时可以完全抑制ABCB1/MDR1/Pgp，并逆转肿瘤细胞多耐药情况。但是血清浓度仅1-2mol/L时即可产生心血管系统的不良反应，如低血压、心动过缓等 [10]。之后的第二代药物（如PSC833）和第三代药物（LY335979）在研发时均以降低毒性为主要方向。虽然这些新药在细胞和动物实验室起到了良好的药物抵抗作用，但在三期临床试验时却都没有显著的疗效[l2] [22]。因此，维拉帕米仍然是临床研究验证过的，目前最有效、也可以最快应用于临床的ABCB1/MDR1/Pgp抑制剂。

在肝癌的临床治疗实践中发现，维拉帕米抗耐药治疗的副作用可以通过改变给药途径解决。肝正常组织的营养由门静脉提供，而HCC则依赖于肝动脉系统，利用这一特点的经动脉化学栓塞疗法（transarterial chemoembolization，TACE）是当前主要的HCC药物治疗手段。随着相关临床和基础研究的发展，肝脏定向药物疗法和手术治疗在延长患者生存期上的差距大幅减小 [3]。使用TCGA 进行维拉帕米的肝定向给药，局部微环境的维拉帕米浓度是血液的3-10倍，并远超过抑制ABCB1/MDR1/Pgp活性的临界值，进而可以实现避免心脏毒性条件下的抗肝癌耐药治疗，收到了较好的疗效 [23]。

4小结

腫瘤多药物抵抗现象是限制肝癌化疗效果的主要原因。ABC转运体家族是诱导MDR产生的核心分子，其主要机制包括：介导肝癌细胞的药物外排、促进机体对药物的代谢以及参与肿瘤干细胞导致的肝癌再发。ABC转运体的表达受到炎-癌相关信号网络的调节。维拉帕米可以抑制ABCB1功能，通过靶向肿瘤血管给药可以实现无心脏毒副作用的维拉帕米抗肝癌耐药治疗。通过进一步的分子流行病学和机制研究，可以确定ABC转运体及其核心调控分子在肝癌进化发育中后期的变化规律，揭示与肝癌耐药风险相关的生物标志和治疗靶点。从而进一步完善肝癌管理的第三级预防，有效延长患者生存时间。

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