喻志东，王红宇

(自贡市第一人民医院儿科，四川 自贡 643000)

髓系抑制细胞、Th17细胞在哮喘患儿外周血中的表达

喻志东，王红宇

(自贡市第一人民医院儿科，四川 自贡 643000)

目的 分析髓系抑制细胞(MDSCs)及Th17细胞在哮喘患儿外周血中的表达情况和临床意义。方法 选取自贡市第一人民医院儿科2013年6月至2015年8月收治的120例哮喘患儿作为观察组，另外选择87例健康儿童作为对照组。应用流式细胞术检测MDSCs、Th17细胞在哮喘患儿外周血中的表达情况。结果 和对照组相比，观察组MDSCs占有核细胞的百分比和Th17细胞占单个核细胞的百分比都显著升高(Hc值分别为56.14、45.98，均P<0.05)，差异具有统计学意义。结论 从MDSCs、Th17细胞在哮喘患儿外周血中的表达情况来看，它们可能参与了婴幼儿哮喘的发生与发展过程。

髓系抑制细胞；Th17细胞；哮喘患儿；外周血

众所周知，哮喘是婴幼儿最常见的气道慢性疾病。虽然传统的治疗手段(吸入性糖皮质激素或者联合应用β2受体激动剂)能够控制大部分轻中度哮喘患儿，但是对于部分哮喘患儿，传统的治疗方法很难达到良好的治疗效果。髓系抑制细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)的发现始于20世纪80年代的肿瘤患者体内，是一群异质性细胞群,主要来源于未成熟的髓细胞及骨髓祖细胞，具有很强的免疫调节能力[1-2]，也与哮喘肺部炎症及气道重塑的发生有关[3-4]。辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)是一类新的CD4+T细胞亚群，亦与哮喘息性疾病有关。因此，本文主要分析了MDSCs及Th17细胞在哮喘患儿外周血中的表达情况，同时也探讨了二者在婴幼儿哮喘疾病中的可能作用。

1对象和方法

1.1研究对象

选取自贡市第一人民医院儿科2013年6月至2015年8月收治的120例哮喘患儿为观察组，其中男54例，女66例，年龄3～10岁，平均年龄5.6±2.8岁。同时，选取87例健康儿童为对照组，其中男47例，女40例，年龄3～10岁，平均年龄6.2±2.1岁。对照组儿童无特殊疾病史，在半个月内无感染病史。哮喘患儿的纳入标准：①以《咳嗽的诊断与治疗指南(2009版)》的诊断为依据，符合哮喘病的诊断标准；②患儿首次诊断为哮喘病，并且在15天内没有呼吸道感染病史；③患儿没有激素或者免疫调节剂用药史。排除标准：①患儿有心脏或肝肾等重要器官功能不全病史；②患儿有肺部其他疾病；③患儿的气道有不明原因的发育畸形。选取的所有研究对象均取得家长同意，同时也符合伦理学标准。

1.2实验材料

试验所用仪器和材料：流式细胞仪、低温高速离心机、荧光显微镜、涡旋混合机、酶标仪、自动细胞分类计数仪、IL-17 ELISA试剂盒、人Ficoll淋巴细胞分离液、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、淋巴细胞分离液。

1.3 MDSCs膜表面的标记与染色

在外周血中，用CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+表示MDSC的表达，具体实验步骤如下：①向流式管中加入100μL抗凝血，同时取出荧光抗体将其放入冰盒中；②分别向对应的试管中加入单克隆抗体CD33-PE、CD11b-APC、HLA-DR-FITC及CD14-PEcP各2μL，以上步骤均在避光下操作，并反应15min；③上述步骤结束后分别向各个流式管中加入1mL溶血剂，混匀，在避光条件下反应10min，然后加入PBS，充分混匀后采用流式细胞仪检测。为了防止非染色体染色，在同型对照管中加入同型对照抗体，并调节电压及荧光进行补偿。

1.4外周血单个核细胞的获取及Th17细胞检测

具体实验步骤如下：①分别收集观察组及对照组患儿空腹静脉血3mL，将其用于MDSCs(1mL)及Th17细胞(2mL)的检测；②首先取2mL静脉血，以1:1的比例与PBS稀释混匀，然后将其放入含有等体积的人淋巴细胞分离液的离心管中，离心15min(1 500prm)；③用PBS洗涤吸取出来的云雾层，用RPMI-1640培养液调整细胞悬浮液的浓度，然后将其加到养板中，并加入2μL 50μg/mL 聚丙烯酸(pacific maritime association，PMA)，1μL 100ng/mL 伊屋诺霉素(ionomycin)，最终将其放置在37℃、5%CO2的条件下培养5h；④在同型对照管中加入1×106/mL的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并加入10μL CD4-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomer ，FITC)，在避光的条件下孵育40min；⑤孵育后，洗涤上清液后用多聚甲醛将其固定，在室温的条件下孵育30min，离心取上清液；⑥取出上清液后加入相应的对照抗体，在室温、避光的条件下，孵育15min，PBS洗涤，离心弃上清，加入PBS溶液200μL，充分混匀，流式细胞仪检测。

1.5统计学方法

2结果

2.1 MDSCs占有核细胞的百分比

观察组患儿的外周血中MDSCs占有核细胞的百分比与对照组比较，差异有统计学意义(Hc=56.14，P<0.05)，见表1、图1。

2.2 Th17细胞占单个核细胞的百分比

观察组患儿的外周血中Th17细胞占单个核细胞的百分比与对照组比较，差异有统计学意义(Hc=45.98，P<0.05)，见表1、图2。

表1 观察组与对照组MDSCs、Th17百分比结果[P50(P25，P75)]

Table 1 Proportion of MDSCs and Th17 cells in control group and observation group [P50(P25,P75)]

注：A为对照组，B为观察组。

图1 MDSCs占有核细胞的百分比结果

Fig.1 Percentage of MDSCs in nuclear cells

注：A为对照组，B为观察组。

图2 Th17细胞占单个核细胞的百分比结果

Fig.2 Percentage of Th17 cells in mononuclear cells

3讨论

3.1 MDSCs细胞在哮喘患儿外周血中的表达情况

哮喘是一种气道慢性疾病，随着对哮喘发病机制的不断研究，人们认识到它的发病机制不应该仅仅局限于肺部组织，还应该重视全身的反应机制。相关实验证明哮喘的气道炎症与骨髓干细胞密切相关[5]。MDSCs是一群异质细胞群，它不仅在肿瘤的发生、发展中发挥了重要的作用，而且在脓毒血症、病毒感染、急慢性非特异性炎症，以及哮喘等自身免疫性疾病中也扮演着重要的角色。在人体内，MDSCs的主要表面标志有两种，一是CD33+CD11b+CD14-细胞群，二是Lin-HLA-DR-CD33+[6]。本研究中，以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+作为MDSCs的表面标志表达，结果发现：与对照组相比，观察组患儿体内的MDSCs的比例显著升高，差异具有统计学意义，其原因可能有以下几点：①有研究报道造成患儿哮喘的主要原因就是呼吸道病毒[7]。可知MDSCs不但能促使肿瘤细胞的免疫逃逸，还可以促使呼吸道病毒的免疫逃逸，当病毒在宿主细胞内增殖并长期存在后就可以形成呼吸道慢性炎症;②有研究表明，感染中释放的一些炎症因子，例如，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6等，可以诱导MDSCs的产生[8]，这可能是造成观察组比对照组MDSCs比例升高的主要原因;③当MDSCs高表达时可诱导一氧化氮合酶，进而生成高浓度的一氧化氮。高浓度的一氧化氮不但能使微血管发生渗出的情况，还可以使支气管上皮细胞出现脱落甚至发生功能性的改变，从而使气道的炎症反应加剧。

3.2 Th17细胞在哮喘患儿外周血中的表达情况

Th17细胞是一种辅助细胞，它主要通过分泌一些炎症因子来参与心血管系统、呼吸系统、消化系统及神经系统等的疾病的发生。例如，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-17A/F等都是Th17细胞分泌的炎症因子。IL-17细胞是一种强大的前炎症因子，它和中性粒细胞的增殖、分化息息相关。研究表明：在小鼠肺部炎症反应中，IL-17及Th17细胞的水平都有明显增高的趋势[8]。还有研究发现，Th17细胞参与哮喘的发生、发展过程，并和哮喘病情呈正相关[9]。本研究发现，和对照组相比，观察组哮喘患儿Th17细胞占单个核细胞的比例显著升高，其差异有统计学意义，这表明Th17细胞参与哮喘的发病过程。

综上所述，MDSCs和Th17细胞在哮喘患儿外周血中的表达可能在婴幼儿哮喘疾病的发生、发展中扮演着重要的角色，但是要想弄清楚它们在哮喘疾病中的具体作用机制还需要做更深入的研究。

[1]Zhang Q,Fujino M,Xu J,etal.The role and potential therapeutic application of myeloid-derived suppressor cells in allo-and autoimmunity[J].Mediators Inflamm,2015,2015:421927.

[2]Pyzer A R,Cole L,Rosenblatt J,etal.Myeloid-derived suppressor cells as effectors of immune suppression in cancer[J].Int J Cancer,2016,139(9):1915-1926.

[3]张艳丽,王秀芳,雷瑞瑞,等.哮喘、毛细支气管炎患儿外周血MDSCs、IL-10和IL-12水平及意义[J].西安交通大学学报(医学版),2013,34(4):503-507,550.

[4]陶秋影,雷瑞瑞,王亚哲,等.1,25-(OH)2D3对哮喘小鼠体内髓系抑制细胞及气道炎症的影响[J].重庆医学,2015,44(29):4077-4079,4082.

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[6]李文博,任伟宏,桑锋,等.HIV感染对机体MDSC细胞分化及其免疫抑制功能的影响[J].现代免疫学,2016,36(2):99-103.

[7]Garcia-Garcia M L,Calvo Rey C,Del Rosal Rabes T.Pediatric asthma and viral infection[J].Arch Bronconeumol,2016,52(5):269-273.

[8]程颖,李慧,赵丹丹,等.小细胞肺癌患者外周血中髓样抑制细胞的鉴定及临床意义[J].中华肿瘤杂志,2014,36(8):592-596.

[9]冉雪梅, 赵燕,黄毅,等.阿奇霉素通过抑制Th17细胞功能活性改善小鼠哮喘炎症[J].第三军医大学学报,2013,35(5):421-425.

[专业责任编辑：侯 伟]

Expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma

YU Zhi-dong, WANG Hong-yu

(DepartmentofPediatrics,FirstPeople’sHospitalofZigong,SichuanZigong643000,China)

Objective To analyze the expressions and clinical significance of myeloid derived suppressor cells (MDSCs) and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma. Methods Totally 120 children with asthma in First People’s Hospital of Zigong from June 2013 to August 2015 were selected in observation group, and 87 healthy children were selected in control group. The expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma were detected by flow cytometry. Results Compared to the control group, in the observation group, the percentages of MDSCs cells in nuclear cells and Th17 cells in mononuclear cells were significantly increased (Hc value was 56.14 and 45.98, respectively, bothP<0.05), and the differences were statistically significant. Conclusion Seeing from the expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma, we suspect that MDSCs and Th17 cells may involve in the occurrence and development of child asthma.

myeloid derived suppressor cells (MDSCs); Th17 cells; children with asthma; peripheral blood

2016-08-29

喻志东(1979-)，男，主治医师，主要从事小儿呼吸内科工作。

王红宇，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.02.008

R725.6

A

1673-5293(2017)02-0124-02