李景涛 ，刘英军 ，解小锋 ，段春玲 ，赵文超 ，沈善超 ，周彩琴 ，范志强 *

（1.山东省林木种苗和花卉站，山东 济南250014；2.山东省经济林管理站；3.诸城市万景源农业科技有限公司）

L35杨为欧美杨，雌株，干直，抗逆性强，适应范围广，育苗及造林成活率高，速生。杨树作为我省人工栽培面积最大的树种，目前普遍出现了种质退化以及病毒病严重的情况，造成这一现象最重要的原因是以苗繁苗、繁育种苗所用的种条老化，病毒积累严重，造成种条质量差。利用微体快繁技术，可部分脱去病毒，使杨树良种复幼复壮，利用组培苗建设标准化采穗圃，用采穗苗的种条做为繁殖材料来建设良种繁育圃，可提高种苗的质量，对于推动良种的产业化健康发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料的选择

供试品种为L35杨，取春季大田生长的顶芽和带腋芽的茎段作为外植体。

1.2 实验方法

1.2.1 无菌体系的建立和外植体的诱导

取带腋芽的茎段，剪去叶片，留叶柄基部，用流水冲洗干净，在超净工作台上，用75%的酒精浸30秒，根据材料的幼嫩程序，0.1%的升汞溶液处理7～15min、无菌水冲洗5遍。切取顶芽和茎段接种到1/2MS空白培养基中。培养条件：温度25℃，光照度2000～2500LX，光照每天12小时。

1.2.2 分化培养基的筛选

基本培养基为MS附加3%蔗糖，激素采用三因素 （6-BA，GA3，NAA，）， 三水平 （6-BA 0.05、0.1、0.15 mg/L ；GA3 0、0.1、0.2 mg/L ；NAA 0.01、0.02、0.03 mg/L）的正交实验设计，以分化系数为主要观测指标，同时观测愈伤组织的大小。实验设计如下表

表1 不同浓度激素对L35杨试管苗增殖影响正交实验设计L9（33）

切取诱导培养形成的顶芽和腋芽，切取2～3cm的嫩梢，转入上述9种不同培养基中，每个组合25株，培养条件同上，培养25天后统计实验结果。

1.2.3 生根培养基的筛选

基本培养基为1/2MS附加2%蔗糖，添加不同浓度 IBA（0.1、0.5、1.0、2.mg/L），研究单一生长素 IBA对生根率和愈伤情况的影响。

从继代MS培养基中选取发育正常的长2.0cm以上的新梢作为生根材料，插入上述生根培养基中。每种处理25株生根苗，培养条件同上，观察统计生根率和愈伤组织状况。

2 实验结果与分析

2.1 无菌体系的建立和外植体的诱导

实验结果表明：L35杨外植体最适升汞处理时间为9min，经升汞表面消毒转到1/2MS空白培养基中，平均污染率为75%。成活的外植体在培养基中培养7～9天后，顶芽开始生长，腋芽萌动，20天后长成2cm左右的嫩梢。

2.2 分化培养基的筛选

外植体在9个分化培养培养基中培养10天左右均开始诱导出不定芽，25天后各组合均诱出不定芽和愈伤组织，具体结果如表2：

表2 不同浓度激素对L35杨试管苗增殖影响结果

通过对实验结果的统计分析表明：L35杨试管苗理论最适分化培养基为：MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.03mg/L，与组合7相同，分化系数可达到4.6，愈伤组织偏大。实际最适分化培养基为MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L，分化系数可达4.0，愈伤组织大小适中。同时通过极差分析,三种激素对对L35杨试管苗分化的影响程度为 6-BA＞NAA＞GA3，6-BA对L35杨的分化系数影响最大。

鉴于在实际生产中，愈伤组织偏大会造成基部易褐化，在接种时会造成较大的工作量，因而在实际生产上采用的分化培养基为：MS+IBA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖。通过连续的分化培养，验证分化培养基的稳定性。

表3 不同IBA浓度对L35杨试管苗生根的影响

2.3 生根培养基的筛选

接种到上述四种生根培养基中小苗培养15天左右长出放射状不定根，20天后统计4个组合的生根率，结果如表3：

由上述实验结果可知，L35杨的生根对IBA的反应较为敏感，四个不同浓度处理生根率均较高，但愈伤都较大，不利于驯化。根据这一实验结果，将IBA 的浓度降为（0.01、0.02、0.05mg/L）三个梯度，以0.1做对照。实验结果如下：

表4 低浓度IBA对L35杨试管苗生根的影响

实验结果表明：L35杨试管苗最适生根培养基为1/2MS+IBA0.02mg/L+2%蔗糖生根率为97.22%，诱导的根系较多，呈白色放射状，愈伤大小合适，长势良好，驯化后成活率高。

3 结论

本实验通过对L35杨微体快繁体系的研究，确定了最佳分化培养基为MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖，分化系数为4.0，分化系数较高，分化苗生长势较好，愈伤适中。最适生根培养基为1/2MS+IBA0.02mg/L+2%蔗糖 ，生根率为97.22%，生根率较高，生根质量好，根系呈放射状，愈伤组织小，有利于驯化成活。L35杨微体快繁体系的建立，为L35杨的工厂化和规模化育苗打下了基础。