张郴+宾婕

摘 要：目的：比较两种处理方法对脂溶性样品中正二氢愈疮酸的萃取和纯化效果的影响。方法：选择了三种脂溶性样品采用加标回收试验的方式，比较了甲醇和水混合萃取溶剂，甲醇：水=8：2（体积比）方法与正己烷一乙腈分配方法对正二氢愈疮酸（NGDA）纯化效果的影响，用高效液相色谱法（HPLC）进行分析。结果：用甲醇和水混合萃取法对正二氢愈疮酸的萃取效率高，纯化效果好。结论：该方法操作简便、快速，适合于正二氢愈疮酸（NGDA）抗氧化剂的提取，从而能够快速、准确地获得样品信息。

关键词：高效液相色谱；脂溶性样品；抗氧化剂正二氢愈疮酸；纯化效果

中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）04-0193-03

1 正二氢愈疮酸简介

正二氢愈疮酸是一种主要的木脂素，在美国西南和墨西哥生长的一种Larrea tridentate Coville灌木中被发现。然而，在饮用了含有正二氢愈疮酸的茶叶或是食用了含有5～10%干重的正二氢愈疮酸胶囊后[1]，出现了非感染性肝炎的病例[2]，同时研究报告结论表明过量摄入正二氢愈疮酸会导致肾损伤。然而，其他一些报告显示了一些抗氧化剂潜在的毒性、致癌性和致突变性[3]。

对于油脂类样品的溶剂提取方法，李秀勇等[4]往油脂样品中加入饱和NaCl溶液，用正己烷饱和乙腈提取，萃取后再用氮气吹干定溶。郑毅等[5]用正已烷饱和的乙腈直接提取。Mitsuo OISHI等[6]用乙酸乙酯，并且配合减压浓缩手段来进行样品前处理。但大多数报道的前处理方法比较复杂。

国内外关于正二氢愈疮酸的检测报道较少，方法主要有HPLC—DAD[7-8]、HPLC-FLD[9]、Lc-Ms[10]和毛细管电泳法[11]，但大多数操作繁琐。

本文考查两种不同处理方法对脂溶性样品中的正二氢愈疮酸的分离、纯化效果，用高效液相色谱法快速测定，该方法简单、稳定，以为正二氢愈疮酸的检测提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

高效液相色谱仪：美国安捷伦1200，配置柱温箱、梯度洗脱功能和荧光检测器），色谱柱CAPCELL PAK CR（3.5um，250×4.6 mm），分析天平（德国赛多利斯）（精确至0.1mg），超声发生器（江苏昆山市超声仪器有限公司，KQ-50DA），离心机（天津市离心仪器有限公司），旋转真空蒸发器（江苏常州市澳华达仪器厂）。

2.1.2 试药

正二氢愈疮酸（纯度大于97%；Newjersey，USA；A0196169），表香、秘鲁、吐噜样品购于市场，乙腈（色谱纯， 美国TEDIA天地试剂公司，1008916），甲醇（色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司，1007901），抗坏血酸（天津市化学试剂三厂），水（自制超纯水），正己烷（分析纯，天津市永大化学试剂开发中心，20050708）。

2.2 方法与结果

2.2.1 标准溶液和样品的配制

（1）标准溶液的配制。准确称取约5mg（精确至0.1mg）正二氢愈疮酸标品，置于100mL容量瓶中用0.1%AsA甲醇定容至刻度，摇匀。（2）样品的配制。①甲醇和水混合萃取法。分别准确称取约2.5g表香、秘鲁、吐噜样品于100mL具磨口玻璃塞的锥形瓶中，准确加入30mL甲醇-水组成的混合萃取溶剂，超声萃取10min；将超声萃取液移入50mL具塞容量瓶中，分别用5mL上述混合萃取溶剂三次清洗锥形瓶，将清洗溶液注入至容量瓶中，并用混合萃取溶剂定容至刻度后，充分摇匀定容后的萃取溶液；将3mL定容后的萃取液置于10mL带塞的离心试管中，在5000r/min转速条件下离心分離10min；取1mL上清液过0.45μm滤膜后，进行液相色谱分析，外标法定量。②正己烷一乙腈分配法。称取约1.2g表香、秘鲁、吐噜样品于离心管中，加人5mL乙睛饱和的正己烷，在液体混匀器上快速混匀以充分溶解样，加人10mL正己烷饱和的乙睛，于液体混匀器上快速混匀1min，静置分层，用胶头吸管将乙睛层转人浓缩瓶内。如上操作再用乙睛提取两次，合并乙睛于浓缩瓶内。乙腈提取液在40℃下，用旋转真空蒸发器浓缩至约1mL，将浓缩液转至5mL刻度管中，用异丙醇定容至2mL，经0.45um滤膜过滤，供分析。

2.2.2 结果

（1）HPLC色谱条件。高效液相色谱仪：美国安捷伦1200，色谱柱：CAPCELL PAK CR（3.5um，250×4.6mm），流动相A：乙腈，流动相B：水；0～5minA相30%，5～20min，A相30～35%。柱温：40℃；流速：1mL/min；进样体积：10μL；检测器检测波长，λex/λem=280/306nm；对照品及样品的色谱图如图1所示。

（2）线性关系考察。分别准确移取0.1、0.3、0.5、1.0、2.0mL正二氢愈疮酸对照品溶液2.2.1（1）至50mL容量瓶中，采用含0.1%AsA的甲醇溶液定容至刻度。高效液相色谱仪分析，测定其峰面积，以浓度X（ug/mL）为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。

Y=12.86 X+0.0151，r=1

结果表明正二氢愈疮酸标品浓度在0.1008～2.016 ug/mL范围内线性关系良好。

（3）精密度试验。分别精密吸取2.2.1（1）项下的正二氢愈疮酸对照品溶液10μL，连续进样5次，记录色谱图，计算正二氢愈疮酸的峰面积和相对标准偏差（RSD），结果RSD为0.30%。

（4）稳定性试验。精密吸取甲醇和水混合萃取法制备的同一表香加标样品溶液10μL，分别于0，2，4，8，12h进样，记录色谱图，计算正二氢愈疮酸的峰面积和相对标准偏差（RSD），结果RSD为1.06%。

（5）重复性试验。取同一表香样品5份，精密称定，按2.2.1（2）①项下方法制备，进样测定，计算正二氢愈疮酸的峰面积和相对标准偏差（RSD），结果RSD为0.32%。

（6）加标回收率试验。对表香样品进行不同浓度水平的加标后，按照2.2.1（2）①项下方法制备，计算其加标回收率，结果正二氢愈疮酸的平均加样回收率为99.30%（RSD= 1.51%）。

（7）样品含量测定。取表香样品，分别按2.2.1（2）项下方法制备供试品溶液，进样6μL，记录正二氢愈疮酸的峰面积，由线性方程计算各自含量，测定结果见表1所示。

3 结语

实验结果表明：甲醇和水混合萃取法操作简便、快速、萃取效率高，纯化结果好，适合于药用正二氢愈疮酸（NGDA）抗氧化剂的提取，从而能够快速、准确地获得样品信息。相对而言，正己烷一乙腈分配法操作复杂、繁琐、萃取效率低，并且峰型不易分开，纯化效果差。由此得出：用甲醇和水混合萃取法可以得到更好的萃取效果。

參考文献

[1]段沅杏，贺兵，李干鹏，等.食品中正二氢愈疮酸含量的高效液相色谱法荧光法测定[J].云南化工，2011（1）：42-47.

[2]Craigo J，Callahan M，Huang R C， et al.Inhibition of human papillomavirus type 16 gene expression by nordihydroguaiaretic acid plant lignan derivatives [J].Antivir Res，2000（1）：19-28.

[3]Chen H，Teng L，Li J N， et al. Antiviral activities of methylated nordihydroguaiaretic acids. 2. Targeting herpes simplex virus replication by the mutation insensitive transcription inhibitor tetre-O-methyl-NDGA [J].J Med Chem，1998（16）：3001-3007.

[4]李秀勇，牟峻，刘惠涛，胡之德.超高效液相色谱-质谱法测定油脂中的10种抗氧化剂[J].分析化学，2008（3）：369-372.

[5]郑毅，李明儿.HPLC_FLD法同时测定食品中五种抗氧化剂[J].口岸卫生控制，2003（5）：35-36.

[6]Mitsuo OISHI，Toshiharu MATSUDA， Shuko NOJIRI and Kazuo SAITO.Simultaneous Determination of Five Antioxidants in Food by HPLC with Fluorescence Detection，2002（2）：104-109.

[7]Asanoma M，Takahashi K，Miyabe M.Suppressive effects ofnordihydroguaiaretic acid on tumor initiation and promotion in mouFm skin[J].JEMS Abstracts/Mutation Research，1995（334）：388-389.

[8]俞晔，顾燕，曹文忠，等.高效液相色谱法同时测定实用油中9种抗氧化剂[J].食品科技，2007（1l）：181-183.

[9]张曼，何佳，林安清，等.岛效液相色谱法同时测定饲料中8种抗氧化剂[J].口岸卫生控制，2006（5）：30-32.

[10]郑毅，李明元.HPLC—FLD法同时测定食品中五种抗氧化剂[J].口岸卫生控制，2003（5）：35-36

[11]李秀勇，牟峻，刘慧涛，等.超高效液相色谱一质谱法测定油脂中10种抗氧化剂[J].分析化学，2008（3）：369-372.