廖莎 霍凤敏 杨新婷 唐神结 陈效友 孙照刚



·论著·

白细胞介素-9在肺结核患者血浆和T细胞中表达水平的研究

廖莎 霍凤敏 杨新婷 唐神结 陈效友 孙照刚

目的 比较肺结核患者、结核潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者和健康人群血浆中白细胞介素-9(interleukin-9，IL-9)表达水平，以及各人群辅助性T细胞9(Th9)细胞亚群经结核特异性早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target 6 kD，ESAT-6)刺激前后的变化，探索IL-9的表达特点。方法 选取2015年4月至2016年4月于首都医科大学附属北京胸科医院结核科住院治疗的43例初治肺结核患者作为肺结核组；LTBI 组和健康对照组均来自2015年12月于本院进行体检的健康体检者，其中健康对照组33名，LTBI组38例。收集研究对象血浆，采用酶联免疫吸附法检测其血浆中IL-9水平；采用流式细胞术检测各组人群外周血单核淋巴细胞经ESAT-6刺激前后Th9细胞的比率。结果 肺结核组血浆IL-9表达水平为175.04(149.67～221.70) pg/ml，LTBI组为60.21(48.43～102.37) pg/ml，健康对照组为88.19(73.82～113.79) pg/ml。肺结核组血浆IL-9表达水平明显高于LTBI组(Z=7.64，P<0.01)和健康对照组(Z=5.18，P<0.01)。肺结核组Th9淋巴细胞比率为0.17% (0.14%～0.23%)，LTBI组为0.14%(0.10%～0.16%)，健康对照组为0.15%(0.11%～0.20%)，各组间比较差异无统计学意义(H=4.45，P>0.05)。经ESAT-6刺激培养后，肺结核组Th9细胞比率为0.11%(0.09%～0.14%)，LTBI组为0.10%(0.07%～0.12%)，健康对照组为0.11%(0.11%～0.14%)，三组比较差异无统计学意义(H=1.13，P>0.05)；各组刺激前后Th9细胞比率，肺结核组差异有统计学意义(Z=-3.20，P<0.05)；LTBI组差异有统计学意义(Z=-3.32，P<0.05)。结论 IL-9在肺结核患者血浆中的表达水平高于LTBI者和健康人群，其对肺结核诊断具有一定的辅助价值。

结核，肺； 白细胞介素9； 酶联免疫吸附测定； 流式细胞术； 评价研究

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的一种慢性传染性疾病，全球约有1/3的人群感染MTB，约有5%～10%的结核潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者发展为活动性结核病[1-2]。我国是结核病高发国家，LTBI率达44.5%[3]。现有的诊断方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)和γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)等目前广泛使用的结核病免疫诊断方法，不能满足现实的需求[4-6]。因此，探索用于辅助诊断的新方法将有力促进结核病的控制[7]。

白细胞介素-9(interleukin-9，IL-9)主要由新型效应性T细胞Th9分泌，同时Th2、Th17、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)、自然杀伤性T细胞(nature killer T cell，NKT)和肥大细胞等也可以分泌。IL-9是一种多效应的细胞因子，在多种疾病中起着重要的应答和调节作用[3]，其在活动性结核病患者血清中的分泌水平高于健康人群。但是，目前尚没有系统比较IL-9在肺结核患者、LTBI者和健康人群中表达差异的研究。笔者通过检测健康人群、LTBI者和肺结核患者血浆中IL-9表达水平，以及各人群Th9细胞亚群经结核特异性早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target 6 kD，ESAT-6)刺激前后的变化，探索IL-9的表达特点。

对象和方法

一、研究对象和样本收集

选取2015年4月至2016年4月于首都医科大学附属北京胸科医院结核科住院治疗的初治肺结核患者作为肺结核组，共43例；患者均经临床症状、胸部CT扫描、痰涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养及菌群鉴定确诊，其中11例痰培养阳性，9例痰涂片抗酸染色阳性，其余23例经病理学、影像学和GeneXpert检测确诊，且入组前治疗时间均≤4周。排除慢性非传染性疾病(如糖尿病、肺部肿瘤)、自身免疫性疾病(如肾炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)、感染性疾病(如病毒性肝炎、寄生虫感染等)、其他呼吸系统疾病患者，以及HIV感染者和免疫抑制剂使用者。

LTBI组和健康对照组均来自2015年12月于首都医科大学附属北京胸科医院进行体检的健康体检者。健康对照组共33名， TST硬结平均直径均<5 mm，经结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测提示MTB感染阴性，无咳嗽、咯痰、发热等相关症状，无慢性病史，无呼吸系统疾病。LTBI组共38例， TST硬结平均直径均>10 mm，T-SPOT.TB检测阳性，均无咳嗽、咯痰、发热等相关症状，胸部X线摄影检查无异常，无慢性病史，无呼吸系统疾病。

所有研究对象均抽取4 ml静脉血于肝素钠抗凝管中备用。本研究经首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准，研究对象入组前均签订知情同意书。

二、主要设备和试剂

1.设备：流式细胞分析采用美国BD公司FACSCalibur型流式细胞仪，酶标仪为美国Thermo Fisher公司生产。CO2培养箱购自上海Heal Force公司。离心机购自日本日立公司。

2.试剂：IL-9检测试剂盒购自美国Cloud-Clone公司。单克隆抗体：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC、溶血素、阻断剂均购自美国BD公司；IL-9-PE、固定剂和破膜剂均购自美国eBioscience公司；ESAT-6特异性抗原购自英国Oxford公司；RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司。

三、实验检测

1.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)：取各组研究对象静脉血液3 ml于肝素钠抗凝管中，4 ℃离心15 min，离心转速为3000 r/min，离心半径为15 cm。收集上清于冻存管中，置于-80 ℃冻存备用。ELISA法检测研究对象血浆IL-9水平，操作过程严格按照试剂盒说明进行。

2.流式细胞术分析：取研究对象肝素钠抗凝血0.5 ml于12孔细胞培养板中，加入RPIM1640培养基充分混匀，总体积1 ml。研究对象均设置ESAT-6刺激培养组和未刺激组。抗原刺激组加入ESAT-6(终浓度为10 μg/ml)，未刺激组加入等体积RPMI1640培养基，充分混匀，置于5% CO2培养箱中，37 ℃孵育。20 h后在培养体系中加入阻断剂，终浓度为0.7 μl/ml，继续培养5～6 h。进行细胞表面CD3-PerCP、CD8-APC、溶血素、破膜剂、细胞内IL-9-PE因子染色。具体操作均参照各抗体说明书进行。应用流式细胞仪进行结果检测分析。在淋巴细胞设门里分析CD3+细胞表达情况，在CD3+细胞设门里分析Th9细胞的表达情况。

四、统计学分析

结 果

一、基本情况

肺结核组43例，其中，男23例(53.5%)，女20例(46.5%)，平均年龄(36.5±10.5)岁；LTBI组共38例，其中，男20例(52.6%)，女18例(47.4%)，平均年龄(34.4±12.9)岁；健康对照组共33名，其中，男18名(54.5%)，女15例(45.5%)，平均年龄(27.7±5.2)岁。三组研究对象年龄和性别构成均衡可比(F=1.58，P=0.119；χ2=0.02，P=0.980)。

二、血浆IL-9水平检测

肺结核组血浆IL-9表达水平为175.04(149.67～221.70) pg/ml，LTBI组为60.21(48.43～102.37) pg/ml，健康对照组为88.19(73.82～113.79) pg/ml。肺结核组血浆IL-9表达水平明显高于LTBI组(Z=7.64，P<0.01)和健康对照组(Z=5.18，P<0.01)，健康对照组和LTBI组比较，差异无统计学意义(Z=-2.11，P>0.05)。

三、外周血单核细胞中Th9细胞比率

血浆中的IL-9主要来源于Th9淋巴细胞，因此，进一步采用流式细胞分析技术检测Th9淋巴细胞在外周血单核细胞中的比率。结果显示，肺结核组Th9淋巴细胞比率为0.17% (0.14%～0.23%)，LTBI组为0.14%(0.10%～0.16%)，健康对照组为0.15%(0.11%～0.20%)，各组间比较差异无统计学意义(H=4.45，P>0.05)。

四、抗原刺激对Th9细胞比率的影响

在结核特异性抗原ESAT-6刺激培养后，肺结核组Th9细胞比率为0.11%(0.09%～0.14%)，LTBI组为0.10%(0.07%～0.12%)，健康对照组为0.11%(0.11%～0.14%)，三组比较差异无统计学意义(H=1.13，P>0.05)。分别比较各组研究对象经ESAT-6刺激培养前后Th9细胞比率，肺结核组差异有统计学意义(Z=-3.20，P<0.05)；LTBI组差异有统计学意义(Z=-3.32，P<0.05)；健康对照组差异无统计学意义(Z=-1.83，P>0.05)。

讨 论

免疫学方法是一种简单、快速、无创的结核病辅助诊断方法，本研究探索了IL-9在肺结核患者中的分泌特点及其潜在的应用价值。IL-9是主要由新型效应T细胞Th9淋巴细胞分泌的一种细胞因子[8-9]，同时CD8+T细胞、γδ T细胞也有一定的分泌[10]。研究表明，IL-9 是一种具有多种生物学功能的细胞因子，参与机体多种疾病的免疫调节过程。研究发现，IL-9在诸如慢性乙型肝炎[11]、寄生虫感染[12]等患病过程中表达升高，但在幽门螺旋杆菌感染中有不同的报道[13-14]。另有研究表明IL-9在肺结核患者血清中的表达水平高于健康人群[7,10]。本研究用ELISA方法检测肺结核患者、LTBI者、健康对照者血浆中IL-9的表达水平，研究发现肺结核患者血浆中IL-9的表达水平明显高于健康对照者，与其他研究结果相似[7]，同时本研究发现肺结核患者血浆中IL-9的表达水平明显高于LTBI者。可见，血浆中IL-9水平的检测对于结核病诊断有一定的辅助意义。

同时，笔者在细胞水平检测了Th9细胞的比率，通过流式细胞技术分析研究对象经结核特异性抗原ESAT-6刺激前后Th9细胞在外周血单核细胞中比率的变化。结果表明，肺结核患者Th9细胞比率与LTBI者及健康人群相比差异没有统计学意义。考虑由于淋巴细胞亚群中Th9细胞的比率较低，流式细胞检测术敏感度不足，因此，本次研究未能发现Th9细胞的比率在肺结核患者、LTBI者和健康人群间的差异。

研究发现，IL-9参与损伤Th1型细胞抗结核免疫反应，IL-9的表达水平与γ-干扰素(IFN-γ)的表达水平呈明显负相关甚至拮抗关系，通过外原性中和IL-9或者敲除IL-9基因，可以明显提高体内外IFN-γ的表达水平[15]。同时，IFN-γ可以通过抑制IL-4的表达来降低IL-9的表达水平[16]。笔者发现，通过结核特异性抗原刺激后，肺结核患者Th9细胞比率明显低于刺激前，可能因ESAT-6刺激外周血单核细胞后IFN-γ释放水平上升，从而抑制IL-9的表达[14-15]。

综上所述，本研究发现IL-9在肺结核患者血浆中的表达水平明显高于LTBI者和健康对照者，提示有望通过检测人群血浆IL-9来予以区分；肺结核患者血浆标本经结核特异性抗原刺激后，Th9细胞在外周血单核细胞中的比率降低，说明经抗原刺激后流式细胞分析法并不适合Th9细胞比率的检测。针对以上结论，还应扩大样本量进一步研究；同时，本次研究未纳入其他呼吸系统感染性疾病患者，对于IL-9在肺结核与其他呼吸系统疾病中的表达差异有待继续探索。

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(本文编辑：李敬文)

A study of the interleukin-9 expression in plasma and T cells in pulmonary tuberculosis patients

LIAOSha,HUOFeng-min,YANGXin-ting,TANGShen-jie,CHENXiao-you,SUNZhao-gang.

NationalClinicalLaboratoryonTuberculosis,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

Correspondingauthor:SUNZhao-gang,Email:sunzg75@163.com

Objective To compare interleukin-9 (IL-9) expression in plasma and the proportion of Th9 cell subsets change before and after stimulated byMycobacteriumtuberculosisspecific early secreting antigen target 6 kD (ESAT-6) in pulmonary tuberculosis patients, latent tuberculosis infection (LTBI) ones and healthy-control people, in order to explore the feature of IL-9 expression. Methods A total of 43 pulmonary tuberculosis patients with initial treatment were selected from Department of Tuberculosis, Beijing Chest Hospital, Capital Medical University between April 2015 and April 2016. The LTBI group (n=38) and the healthy control group (n=33) were all from those who getting physical examination in our hospital on December 2015. Plasma levels of IL-9 were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the ratio of Th9 cells in peripheral blood mononuclear cells was measured by flow cytometry before and after stimulation with ESAT-6. Results The plasma level of IL-9 in pulmonary tuberculosis group, LTBI group, heathy-control group were 175.04 (149.67-221.70) pg/ml, 60.21 (48.43-102.37) pg/ml, and 88.19 (73.82-113.79) pg/ml respectively. The level of IL-9 in pulmonary tuberculosis group was significantly higher than those in LTBI group (Z=7.64,P<0.01) and heathy-control group (Z=5.18,P<0.01). Percents of Th9 in the three groups were 0.17% (0.14%-0.23%), 0.14% (0.10%-0.16%), and 0.15% (0.11%-0.20%) respectively; there was no statistical significance (H=4.45,P>0.05). After stimu-lated with ESAT-6, differences of percents of Th9 in the three groups were 0.11% (0.09%-0.14%), 0.10% (0.07%-0.12%), 0.11% (0.11%-0.14%) respectively and there was no statistical significance in the three groups (H=1.13,P>0.05). However, significant differences of Th9 before and after stimulated with ESAT-6 were found in in pulmonary tuberculosis group (Z=-3.20,P<0.05) and LTBI group (Z=-3.32,P<0.05). Conclusion The plasma level of IL-9 in pulmonary tuberculosis patients is significantly higher than those in LTBI or heathy-control ones, which has subsidiary value in the diagnosis of tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary; Interleukin-9; Enzyme-linked immunosorbent assay; Flow cytometry; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.013

北京市医院管理局临床医学发展专项基金(ZYLX201304)；首都医学发展专项基金(2016-2-1043)；北京结核病临床数据和样本资源库项目(D131100005313012)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室(廖莎、霍凤敏、孙照刚)，结核三科(杨新婷、陈效友)，结核一科(唐神结)

孙照刚，Email:sunzg75@163.com

2016-09-06)