赵咏梅 王瑞 李新宇 贺志高 桂俊豪 张东辉 王晓燕 张峰 张羽 姜鹏



·论著·

ANGPTL4对LPS诱导的人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用

赵咏梅 王瑞 李新宇 贺志高 桂俊豪 张东辉 王晓燕 张峰 张羽 姜鹏

目的探讨ANGPTL4对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)损伤的保护作用。方法以体外培养的HPMVECs作为实验对象，将细胞随机分为四组：正常对照组(C组)、LPS诱导组(L组)、ANGPTL4表达组(A组)和ANGPTL4表达+ LPS诱导组(A+L组)。各处理组细胞分别培养12、24、48、72 h后采用CCK-8法观察细胞增殖；细胞孵育12 h后，采用荧光定量PCR和Wester-blot检测ANGPTL4表达水平， ELISA法检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的蛋白含量。结果与C组相比，L组和A组细胞的ANGPTL4表达明显增高(P<0.01)；与L组相比，A+L组细胞的ANGPTL4表达明显增高(P<0.01)，LPS刺激可以抑制细胞增殖，而经过pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染后这种抑制作用又被削弱了；高表达ANGPTL4抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的生成。结论ANGPTL4可以减弱LPS抑制HPMVECs细胞增殖的作用，降低细胞中TNF-α, IL-1β和MCP-1等炎症因子的生成，这些效应可能是ANGPTL4保护肺微血管内皮细胞的作用机制之一。

ANGPTL4; 急性肺损伤; 人肺微血管内皮细胞

急性肺损伤(severe acute lung injury, ALI)是由各种肺内外因素所致的以急性呼吸窘迫、非心源性肺水肿和持续过度的炎症反应为特点的临床综合征，是爆发性流感、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重症肺炎等疾病死亡的主要原因[1-3]。肺微血管内皮细胞在ALI的发病过程中起着重要作用，包括改变细胞代谢活性，影响肺和全身的动态平衡、介导细胞—细胞黏附特别是介导中性粒细胞黏附、改变气血屏障通透性，促进肺水肿形成等[4]。ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的一个成员，在调节血管发生、脂类代谢、糖类代谢和胰岛素敏感性等具有重要作用，ANGPTL4能显著抑制血管内皮细胞的增殖、趋化性和血管形成，并且显著抑制体内血管内皮生长因子诱导的血管生成和血管渗漏[5-7]。本研究拟通过建立脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells, HPMVECs)损伤的模型，观察ANGPTL4基因表达对内皮细胞的保护作用，评估ANGPTL4对LPS诱导的HPMVECs损伤的影响，探讨其可能的保护作用与机制，为ALI防治提供理论依据和实验基础。

材料和方法

一、实验材料

HPMVECs细胞购自美国ScienCell公司，细胞的复苏和传代培养严格按照产品说明书进行；pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒由本室制备并保存。MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；ANGPTL4、GAPDH抗体购自Abcam公司；LPS购自Sigma公司；抗人TNF-α、IL-1β和MCP-1 ELISA检测试剂盒购自R&D公司；蛋白裂解液、ECL化学发光试剂购自北京普利莱公司；HRP二抗、内参一抗购自GenScript公司；Trizol购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂购自Takara公司；CCK-8购自日本同仁化学研究所。

二、实验方法

1. 细胞转染: 转染前12～18 h，取生长状态良好的HPMVECs，按4×105cells/孔接种于24孔板，转染时稀释5 μg质粒DNA在无血清和抗体的培养基至100 μl，再加入Superfect Transfection Reagent脂质体转染试剂30 μl混匀，室温孵育5～10 min，加入含1 ml培养基的孔中，37 ℃，5% CO2培养3 h后换正常培养基继续培养48 h。

2. 实验分组: 将生长状态良好的HPMVECs细胞接种至6孔培养板，并随机分为四组：对照组(C组)、LPS诱导组(L组)、ANGPTL4表达组(A组)和ANGPTL4表达+LPS诱导组(A+L组)；C组细胞经pcDNA3.1空白质粒转染，A组经pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染的HPMVECs细胞；L组细胞经pcDNA3.1空白质粒转染48 hr加入终浓度为5.0 μg/ml的LPS，A+L组细胞经pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染48 h加入终浓度为5.0 μg/ml的LPS；37 ℃，5% CO2培养12 h后行各项指标的检测。

3. 检测指标: 各组细胞分别继续培养12 h、24 h、48 h、72 h后采用CCK-8法观察细胞增殖(方法同文献[8])；细胞孵育12 h后，荧光定量PCR和Wester-blot检测ANGPTL4表达水平(相关引物序列如表1示，ALB、FOXP2为参考基因，方法同文献[9])； ELISA法检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量，操作严格按照试剂盒说明。

表1 相关引物序列

三、统计学方法

结 果

一、ANGPTL4转染效率

用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染对HPMVECs细胞中ANGPTL4表达的影响，结果显示，与C组相比， L组和A组细胞的ANGPTL4表达明显增高(P<0.01)；与L组相比，A+L组细胞的ANGPTL4表达明显增高(P<0.01)，表明LPS刺激和pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染后都可以使细胞中ANGPTL4的表达增高，见图1A、B。

图1 LPS刺激和pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染后细胞中ANGPTL4的表达；注：A：RT-PCR 检测各组细胞 ANGPTL4基因的表达；B：Western blot检测各组细胞 ANGPTL4蛋白的表达(*P<0.05)

二、ANGPTL4对LPS诱导的细胞增殖的影响

CCK8检测各组细胞在 12、24、48、72 h的吸光度值，绘制增殖曲线，结果显示：与C组相比，L组细胞的增殖受到抑制，差异有显著意义(P<0.05)；而A+L组与L组相比，其细胞的增殖又被促进了(P<0.05)，见图2A；说明LPS刺激可以抑制细胞增殖，而经过pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染后这种抑制作用又被削弱了。

三、ANGPTL4对LPS诱导的细胞炎症因子的影响

采用ELISA检测各组细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量，结果显示, 转染后细胞在炎症刺激下的炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量明显低于LPS刺激组，说明高表达ANGPTL4抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的生成，见图2B。

图2 LPS刺激和pcDNA3.1-ANGPTL4重组质粒转染后对细胞增殖和炎症因子的影响；注：A：CCK8检测各组细胞的增殖；B：ELISA检测各组细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量(*P<0.05)

讨 论

肺微血管内皮细胞位于肺微循环交换血管的最内层，通过细胞间的相互作用以及与细胞外基质的连接构成屏障，参与肺内多种生理功能调节，如宿主防御反应、血管生成和微血管紧张性的维持等[10]。肺微血管内皮细胞损伤和功能失调作为在ALI发病过程的中心环节，可以引起血流动力学和体液平衡改变，促进血循环中的细胞相互作用，从而导致血管通透性增加和肺水肿形成[9]。格兰阴性菌外膜的免疫原LPS刺激内皮细胞活化后，可激活炎症反应，生成大量的炎症因子，导致细胞凋亡或功能障碍[11]，进而引起机体产生一系列级联反应，导致肺组织损伤。

ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的成员之一，在肺、肾、肝脏、垂体、骨骼肌和心脏中均有表达[12-14]。ANGPTL4基因具有多种作用，但其最重要的作用是调节血管发生、脂类代谢、糖类代谢和胰岛素敏感性等。血管发生既是机体生长发育的正常生理过程，又是肿瘤、心血管疾病和各种炎性反应的重要病理基础[5-7]。研究发现ANGPTL4参与调节LPS诱导的肺微血管内皮细胞凋亡[15]，我们的前期研究结果显示, 上调ANGPTL4在小鼠肺内的表达，能够减轻 LPS 诱导的急性肺损伤小鼠肺部炎症损伤反应[9]，本研究结果也显示，LPS诱导HPMVECs中ANGPTL4的表达增加，因此推测ANGPTL4 可能通过调节肺泡上皮细胞的炎症损伤而参与调节ALI的发生发展。

已知TNF-α、IL-1β和MCP-1是重要的炎性介质，可以导致发热、代谢性酸中毒、腹泻、低血压以及弥漫性血管内凝血等[16-19]。在炎症介质的作用下，细胞内多种信号通路被激活，诱导细胞通透性增加，引起细胞损伤并导致细胞凋亡。在ALI的发病过程中肺微血管内皮细胞的凋亡是ALI重要的病理变化。内皮细胞凋亡增加了血管内皮通透性，促进了中性粒细胞黏附到肺微血管内皮细胞，缩短中性粒细胞等炎性细胞迁移到肺间质和肺泡的时间，最终引起肺呼吸换气障碍，加重肺损伤和增加动物死亡率[20-21]，因此减缓促炎因子的释放将有助于保护内皮细胞功能。

基于以上推测，本研究通过建立LPS刺激HPMVECs损伤的模型，观察ANGPTL4基因表达对内皮细胞可能的保护作用，结果显示, 经LPS刺激的HPMVECs细胞增殖被抑制了，同时生成大量的TNF-α、IL-1β和MCP-1。上调ANGPTL4的表达后，HPMVECs的细胞增殖开始明显恢复，并且细胞培养液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的水平也显著降低了，表明ANGPTL4基因表达对LPS刺激的HPMVECs损伤具有一定的保护作用。

ANGPTL4基因作为各种炎症信号通路的连接点，是炎症反应的保护性蛋白，ANGPTL4基因的高表达可能影响炎症因子的相关信号通路如PKC、ERK-MAPK通路等，减少炎症因子的释放，进而保护细胞凋亡，维持内皮细胞的稳定性，保护肺损伤。在LPS 诱导的 ALI 发病过程中，对ANGPTL4的调控基因和相关信号通路的研究将是下一步工作的重点。

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(本文编辑：王亚南)

赵咏梅，王瑞，李新宇，等. ANGPTL4对LPS诱导的人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(2)： 192-195.

Protective effect of ANGPTL4 on human lung microvascular endothelial cell injury

ZhaoYongmei,WangRui,LiXinyu,HeZhigao,GuiJunhao,ZhangDonghui,WangXiaoyan,ZhangFeng,ZhangYu,JiangPeng.

XinjiangMedicalUniversity,MilitaryGeneralHospitalinXinjiangofPeople′sLiberationArmy,Urumchi830000,China

JiangPeng,Email：jipzym@126.com

Objective To investigate the protective effect of ANGPTL4 to human lung microvascular endothelial cell injury. Method Human lung microvascular endothelial cells cultured in vitro were randomly divided into four groups: normal control group (group C), LPS induced group (group L), ANGPTL4 expression (group A) and ANGPTL4+LPS induced group (group A+L). CCK8 method was used to observe cell proliferation; fluorescence quantitative PCR and Western blot were applied to test ANGPTL4 expression level, Inflammatory factor TNF-α, IL-1β and MCP-1in cell culture fluid were also detected by ELISA method. Results Compared with group C, the expression of ANGPTL4 in group L and group A was significantly higher(P<0.01); Compared with group L,The expression of ANGPTL4 in A+L group was significantly higher (P<0.01), LPS stimulation can inhibit cell proliferation, and after pcDNA3.1- ANGPTL4 recombinant plasmid transfection, this inhibition was weakened; high ANGPTL4 expression can also inhibit the generation of inflammatory factor TNF-α, IL-1β and MCP-1. Conclusions ANGPTL4 can inhibit LPS induced HPMVECs cell proliferation decreased, and reduce the generation of Inflammatory factor TNF-α, IL-1β and MCP-1, which may be one of the mechanism of the protective effect of ANGPTL4 to human lung microvascular endothelial cells.

ANGPTL4; Acute lung injury; Human lung microvascular endothelial cell

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.016

新疆维吾尔自治区自然科学基金 资助项目(2013211A062)

830000 乌鲁木齐，新疆医科大学 现为新疆军区总医院

姜鹏，Email：jipzym@126.com

R563

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2016-12-28)