冯文伟 陈伯钧 赵 帅 唐 咏 张为章 陈冬杰 李茂清

(广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510403)

血管紧张素原对动脉粥样硬化的作用及机制

冯文伟 陈伯钧1赵 帅1唐 咏2张为章 陈冬杰 李茂清3

(广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510403)

目的 探讨血管紧张素原(AGT)对动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法 构建AS小鼠模型，RT-PCR检测AS小鼠斑块组织和正常小鼠主动脉血管组织中AGT的表达水平。以人巨噬细胞RAW264.7和人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)为研究对象，转染siRNA AGT、siRNA control，实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染后的AGT水平。MTT检测细胞转染后细胞的增殖情况，流式细胞仪检测转染后的细胞凋亡情况。Western印迹检测转染后细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果 AS小鼠斑块组织中AGT的表达水平高于正常小鼠主动脉组织(P<0.01)。siRNA AGT可以有效抑制巨噬细胞RAW264.7和人主动脉平滑肌细胞HA-VSMC中AGT的转录表达。转染siRNA AGT后的巨噬细胞RAW264.7存活率与siRNA control组比较差异显著(P<0.01)，转染siRNA AGT后的主动脉平滑肌细胞HA-VSMC存活率与siRNA control组差异显著(P<0.01)，抑制AGT的表达可以抑制巨噬细胞和平滑肌细胞的增殖。转染siRNA AGT后的巨噬细胞RAW264.7凋亡率显著高于siRNA control组(P<0.01)；转染siRNA AGT后的主动脉平滑肌细胞HA-VSMC凋亡率显著高于siRNA control组(P<0.01)。转染siRNA AGT后的巨噬细胞RAW264.7和主动脉平滑肌细胞HA-VSMC中Caspase-3、Bax蛋白表达量显著高于siRNA control组，Bcl-2蛋白表达量显著低于siRNA control组(均P<0.01)。结论 AGT在鼠AS斑块组织中过表达，抑制AGT可以抑制AS相关细胞增殖，促进细胞凋亡，作用机制与凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax有关。

动脉粥样硬化；血管紧张素原；平滑肌细胞；巨噬细胞

动脉粥样硬化(AS)的发生和发展与主动脉平滑肌细胞(VSMC)和巨噬细胞具有密切关系〔1〕。血管紧张素原(AGT)是肾素-血管紧张素系统(RAS)唯一的作用底物〔2〕。研究发现，AS在心血管系统中具有重要作用〔3〕。目前尚未见AGT在AS中的相关作用研究。本研究构建了动脉粥样硬化小鼠模型，检测斑块组织中AGT的表达水平，进一步研究AGT对主动脉平滑肌细胞和巨噬细胞增殖凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人巨噬细胞RAW264.7和人VSMC(HA-VSMC)购于上海昱都生物科技有限公司，14日龄的载脂蛋白E(ApoE)基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠8只为正常组，14日龄雄性小鼠8只为实验组，均由长沙天力生物科技有限公司提供。正常组每日正常饮食，实验组用高脂饲料饲喂，两组小鼠均按照相关管理要求饲喂30 d。主要仪器及试剂：酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)，紫外分光光度计(美国Thermo)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，DMEM(美国Sigma)，匀浆器(上海洽姆仪器科技有限公司)，离心机(湖南恒诺医用设备有限公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)，FBS(乐清市虹桥爱科威自动化设备厂)，聚偏氟乙醇(PVDF)膜(上海康朗生物科技有限公司)，脱脂奶粉(雅培)，反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，实时荧光定量PCR检测试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，蛋白浓度检测试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，PBS(上海欣百诺生物工程有限公司)，MTT(上海江莱生物科技有限公司)，PI(北京创根胜泰科技有限公司)，Annexin-V(北京创根胜泰科技有限公司)，胰蛋白酶(美国Sigma)，Bax多克隆抗体、Bcl-2多克隆抗体、Caspase-3多克隆抗体、β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物标记的二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测AGT的表达水平 诱导的AS小鼠断头处死，打开胸腔，取主动脉斑块组织，经匀浆器匀浆后，5 000 r/min，4℃离心5 min后弃上清液，加入冰预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，5 000 r/min，4℃离心5 min，弃上清液，加入Trizol裂解液充分混匀后，放置于冰上静置5 min。加入氯仿，上下剧烈震荡10次，放置于冰上静置10 min，12 000 r/min，4℃离心10 min，吸取上层水相层至新的EP管中，加入等体积的异丙醇充分混匀后，放置于冰上静置10 min，12 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清液，加入浓度为75%的乙醇混匀，12 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清，放置于超净工作台晾干后，加入适量的焦碳酸乙醇酯(DEPC)水溶解RNA。紫外分光光度计检测提取的RNA浓度及纯度。按照反转录试剂盒说明书反转录合成AGT的cDNA，按照实时荧光定量PCR说明书检测AGT的表达水平，分析AGT的表达量。

1.2.2 细胞培养 人巨噬细胞RAW264.7和HA-VSMC细胞用含10% FBS的DMEM细胞生长液在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h后，观察细胞融合度为85%左右时，弃去细胞生长液，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min，弃酶消化液，加入PBS洗涤2次，1 000 r/min离心10 min，加入细胞生长液，接种于细胞培养板中。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期的人巨噬细胞RAW264.7和HA-VSMC，弃细胞培养液，加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min，加入细胞生长液，调整每毫升细胞悬浮液中含有细胞个数为3×105个，接种于6孔细胞培养板中，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。为了提高转染效率，在转染前1 h将细胞生长液换成不含FBS的不完全培养基。分别取siRNA AGT、siRNA control与不完全培养液混合为A液，于室温静置5 min；转染试剂与不完全培养基混合后为B液；分别取A液和B液混合后室温静置20 min后，加入细胞培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱中孵育6 h，更换为完全培养基继续培养48 h。

1.2.4 RT-PCR检测细胞中AGT的表达水平 转染siRNA AGT、siRNA control后的RAW264.7和HA-VSMC细胞经培养48 h后，提取其细胞的RNA，反转录合成AGT的cDNA，RT-PCR检测分析细胞中AGT的表达水平，方法同1.2.2。

1.2.5 (MTT)检测细胞增殖 取处于对数生长期的RAW264.7和HA-VSMC细胞，加入胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心10 min，在细胞沉淀中加入细胞培养液，调整细胞浓度为2×104个/ml，接种细胞至96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬浮液200 μl，37℃，5%CO2培养箱中培养48 h，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h，弃上清液，加入150 μl的二氨基亚砜(DMSO)溶液，缓慢震荡10 min，观察结晶完全溶解后，放置于酶标仪上检测各孔的吸光度，波长为490 nm，计算细胞存活率。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取处于对数生长期转染后的RAW264.7和HA-VSMC细胞，经胰蛋白酶消化后，弃消化液，调整细胞浓度为每毫升中含有2×106个细胞，1 000 r/min离心10 min，加入冰预冷的PBS洗涤细胞2次，加入体积为200 μl的Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl碘化丙啶(PI)和5 μl膜链蛋白(Annexin-V)充分混匀后，在室温下静置15 min，加入体积为300 μl的缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.7 Western印迹检测细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平 取对数生长期转染后的RAW264.7和HA-VSMC，弃细胞生长液，按照细胞蛋白提取试剂盒说明书提取细胞中的总蛋白，用蛋白浓度测定试剂盒说明书测定提取的蛋白的浓度及纯度。蛋白样品与loading buffer充分混匀后，放置于100℃煮沸5 min。取变性后的蛋白样品50 μl，加入上样孔中，电泳初始电压为80 V，电泳30 min后，调整电压为120 V直至电泳结束。取出蛋白凝胶，按照滤纸、PVDF膜、蛋白凝胶、滤纸顺序放置，转膜电流为30 mA，4℃转膜过夜。5%脱脂奶粉封闭后，依次与一抗和二抗孵育后，在暗室中曝光，分析蛋白表达含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 AS小鼠组织中AGT的表达水平 AS小鼠斑块组织中AGT的表达水平(2.14±0.22)与正常小鼠主动脉组织AGT的水平(1.01±0.68)比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 转染后细胞中AGT表达结果 转染后的RAW264.7 siRNA AGT组中AGT的表达水平(0.23±0.12)明显低于siRNA control组(1.00±0.85)(P<0.01)；转染后的HA-VSMC siRNA AGT组AGT的表达水平(0.32±0.04)明显低于siRNA control组(1.05±0.88)(P<0.01)，siRNA AGT可以有效抑制RAW264.7和HA-VSMC中AGT的转录表达。

2.3 MTT检测转染后细胞增殖情况 转染siRNA AGT后RAW264.7存活率〔(0.34±0.04)%〕与siRNA control组〔(0.99±0.08)%〕比较差异显著(P<0.01)，转染siRNA AGT后的HA-VSMC存活率〔(0.28±0.03)%〕与siRNA control组〔(1.00±0.07)%〕差异显著(P<0.01)，抑制AGT的表达可以抑制巨噬细胞和平滑肌细胞的增殖。

2.4 流式细胞仪检测转染后的细胞凋亡情况 转染siRNA AGT后的RAW264.7凋亡率〔(0.53±0.07)%〕显著高于siRNA control组〔(0.14±0.06)%〕(P<0.01)；转染siRNA AGT后的HA-VSMC凋亡率〔(0.62±0.06)%〕显著高于siRNA control组〔(0.18±0.04)%〕(P<0.01)；抑制AGT的表达可以促进巨噬细胞和主动脉平滑肌细胞的凋亡。

2.5 Western印迹检测转染后细胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax表达水平 转染siRNA AGT后RAW264.7中Caspase-3、Bax蛋白表达量(0.29±0.05，0.36±0.06)显著高于siRNA control组(0.14±0.03，0.25±0.07)，Bcl-2蛋白表达量(0.08±0.01)显著低于siRNA control组(0.28±0.04)(均P<0.01)；转染siRNA AGT后的HA-VSMC中Caspase-3、Bax蛋白表达量(0.31±0.08，0.45±0.07)显著高于siRNA control组(0.13±0.02，0.24±0.09)，Bcl-2蛋白表达量(0.15±0.09)显著低于siRNA control组(0.36±0.08)(均P<0.01)。抑制AGT的表达可以抑制Bcl-2的表达，促进Caspase-3、Bax表达。见图1，图2。

图1 Western印迹检测巨噬细胞RAW264.7中蛋白表达

图2 Western印迹检测HA-VSMC中蛋白表达

3 讨 论

AS是最为常见的心血管系统疾病〔4〕。AS会引起血管壁增厚使管腔变窄，增加血管压力，进而引起高血压的发生。平滑肌细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的聚集增生是AS形成的必要条件。

RAS广泛存在于人体的心脏、肾脏、肾上腺、血管等组织系统中，在心血管系统的稳定和正常发育以及血压调节、维持体液平衡等方面发挥重要作用〔6〕。传统观念认为，肾素和AGT的主要来源为肾脏，研究表明，AGT和肾素在骨骼肌、血管平滑肌、心肌、脑等多种组织器官中均有表达〔7〕。RAS在心血管系统中存在局部循环，这种局部循环可以调节心血管系统的活动，在心血管疾病的发生发展中具有重要作用。在人体内，AGT是一种糖基化的球蛋白，由452个氨基酸组成，是RAS的作用底物，在肾素的作用下可以分解为血管紧张素Ⅰ，从而引起一系列的链式反应〔8〕。本研究结果说明抑制AGT的表达可

以抑制VSMC和巨噬细胞的增殖。

细胞凋亡是一种正常情况下的细胞死亡，是细胞维持生命机体活动的重要功能。细胞凋亡受多种基因的严格调控，是一种程序性的细胞死亡，是细胞维持机体内环境稳定的重要途径〔9〕。Bcl-2蛋白家族与细胞的凋亡具有密切关系，根据其在细胞凋亡中的作用可以分为两类，一类是可以促进细胞凋亡的蛋白称为促凋亡蛋白，主要有Bax，还有一类在细胞凋亡过程中发挥抑制作用的蛋白如Bcl-2蛋白〔10〕。细胞凋亡时，促凋亡蛋白增多，抑凋亡蛋白减少。Caspase-3作为Caspase蛋白家族中的成员之一，是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志之一〔11〕。本研究结果说明AGT可以促进巨噬细胞和平滑肌细胞的增殖，抑制细胞凋亡，作用机制与Bcl-2、Bax和Caspase-3有关。

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〔2016-12-12修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

广东建设中医药强省立项资助项目(20151114)

陈伯钧(1962-)，男，硕士，主任医师，主要从事心血管疾病临床与基础研究。

冯文伟(1979-)，男，2015级硕士，副主任医师，主要从事中西结合治疗心血管疾病临床与基础研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)08-1871-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.021

1 广东省中医院大学城医院急诊科

2 广州中医药大学第三附属医院心血管科

3 梅州市残联康复医院康复科