徐 虎 包乐群 吕胜启

(华中农业大学医院，湖北 武汉 430070)

miR-301a促进人结肠癌细胞株HT29细胞侵袭与转移的机制

徐 虎 包乐群1吕胜启2

(华中农业大学医院，湖北 武汉 430070)

目的 探讨miR-301a对结肠癌侵袭转移的影响及分子机制。方法 实时荧光定量PCR检测40例结肠癌患者癌组织中miR-301a的表达水平，探究结肠癌和miR-301a表达的关系。同时在人结肠癌细胞株HT29细胞过表达和干扰miR-301a，MTT法检测miR-301a对HT29细胞增殖的影响。蛋白免疫技术和实时荧光定量PCR在分子水平上检测miR-301a表达对HT29细胞中侵袭相关分子的表达水平，探究miR-301a调控下的转化生长因子(TGF)-β/Smad4/基质金属蛋白酶(MMP)-9信号通路对结肠癌侵袭转移的影响。结果 实时荧光定量PCR结果显示40例结肠癌患者癌组织中miR-301a的表达水平明显升高，且随着肿瘤分期分级的升高，其水平明显升高。MTT法检测发现过表达miR-301a的HT29细胞数量明显增加，而干扰miR-301a则细胞数目减少，表明miR-301a可促进结肠癌细胞的增殖。在分子水平上蛋白免疫技术和实时荧光定量PCR检测结果显示miR-301a通过下调TGF-β和Smad-4的表达，促进MMP-9的表达，最终促进癌细胞的侵袭转移。结论 miR-301a通过下调TGF-β/Smad4信号通路，促进MMP-9的表达，最终促进结肠癌的侵袭转移。

miR-301a；结肠癌；基质金属蛋白-9；侵袭；转移

目前结肠癌的发病率逐年攀升，预后和5年生存率主要取决于癌细胞转移与否。转化生长因子(TGF)-β作为分泌蛋白，介导丝氨酸/苏氨酸激酶受体后的信号通路〔1，2〕，参与TGF-β/Smad信号通路的调控〔3〕。TGF-β/Smad信号通路已被证明参与多种癌症的致癌作用，如诱导癌细胞的增殖、分化、迁移以及上皮细胞的间质化〔4〕。miR-301a作为原癌基因，其表达失调可影响到众多肿瘤的发生，目前miR-301a在不同肿瘤中的表达和作用尚存在争议〔5〕。有研究发现，miR-301a通过下调Smad4的表达促进胰腺癌的发生。miR-301a通过调节AR/TGF-β1/Smad/基质金属蛋白酶(MMP)-9信号通路促进前列腺癌的侵袭和转移〔6〕。此外，miR-301a是阿霉素耐药性骨肉瘤的潜在生物标志物，借助调控miR-301a的表达改善骨肉瘤的阿霉素耐药性〔7〕。miR-301a的高表达通常与三阴性乳腺癌预后不良相关〔8〕。但是对于miR-301a在结肠癌中的表达及作用目前尚无文献报道，本研究旨在探讨miR-301a在人结肠癌细胞株HT29细胞侵袭与转移中的作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备 细胞培养超净台和细胞培养箱(Thermo Scientific公司)，微量移液器(Eppendorf公司)，PCR仪(Bio-Rad公司)，实时荧光定量PCR系统ABI7500(Applied Biosystems公司)。

1.2 主要试剂和材料 胎牛血清(Ausgene公司)，DMEM培养基(Life technology)，Lipo2000 (Invitrogen)，opti-MEM培养基(Gibco)，RIPA裂解液(碧云天)，Trizol(Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC)水(sigma)，反转录试剂盒(Invitrogen公司)，SYBR green (罗氏)。miRNA-301a前体片段及阴性对照片段，miRNA-301a anti-sense片段及阴性对照片段均购自Ambion公司，且经上海生工公司测序鉴定。miR-301a、Smad-4和MMP-9引物使用primer 5.0设计并由生工合成，miR-301a正义：5′-CTATGCCCGTATTGACGGCCAT-3′,反义：5′-CGAACGTGGTTCGTACGGGTAA-3′;Smad-4正义：5′-AGGCTTGCATTGCAACGGTTCAC-3′,反义：5′-TGACGTCTTGCACTCGGACCTGCC-3′;MMP-9正义：5′-CCCAAACGTGGTCCGTACCGTC-3′,反义：5′-TCGCCAGTTTGCCCGTACGCG-3′;GAPDH正义：5′-GACCCGATCCTGGAACTGATTAG-3′,反义：5′-GGGACCTTGCTTTGCATCGACC-3′。

1.3 样本来源 选取2013年9月至2014年12月在武汉市华中农业大学医院普外科室住院的结肠癌患者40例为实验组，其中男25例，女15 例，年龄47～72岁。所有入组患者的肿瘤分期和分级均参照AJCC/UICC颁布的结直肠癌的肿瘤分期和分级标准，结肠癌Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例，Ⅳ期9例，所有患者病情稳定，无肿瘤出血、肠穿孔、肠梗阻、急慢性感染等并发症。另选取结肠癌I期患者癌旁手术组织作为对照组。

1.4 细胞培养和细胞转染 人结肠癌细胞株HT29细胞购自中科院上海细胞库，细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃ 5% CO2的培养箱中。同时取对数生长期HT29细胞进行转染，转染miR-301a前体片段、miR-301a anti-sense片段及阴性对照片段作为过表达组、干扰组和对照组。转染方法按照Life technology公司的Lipo 2000说明书操作。转染48 h后，提取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR检测HT29细胞中miR-301a过表达及干扰情况，同时提取RNA检测相关基因在mRNA水平的表达量。

1.5 噻唑蓝(MTT)法检测miR-301a对HT29细胞数量的影响 细胞转染24 h后，用Tripsin-EDTA消化细胞制成细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔5×103个细胞，100 μl/孔。细胞贴壁后再培养12 h，用磷酸盐缓冲液(PBS)配制5 mg/ml MTT溶液，每孔加20 μl，注意保持避光继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔避光加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)充分融解结晶物，在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值，计算细胞的相对数量。

1.6 实时荧光定量PCR 结肠癌肿瘤组织以及HT29细胞的总RNA用Invitrogen公司Trizol提取，具体步骤包括Trizol室温裂解、氯仿沉降蛋白、异丙醇沉淀RNA，75%酒精(DEPC水配制)洗涤RNA、DEPC水溶解RNA，最后检测RNA纯度及浓度。按照M-MLV reverse transcriptase逆转录系统对结肠癌肿瘤组织以及HT29细胞的总RNA进行反转录得到cDNA。使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR检测miR-301a、Smad-4和MMP-9在mRNA水平上的含量。

1.7 统计学方法 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR检测结肠癌组织中miR-301a的表达水平 结肠癌患者癌组织中miR-301a表达明显高于对照组，且随着结肠癌分级分期的升高，miR-301a表达水平亦升高，这表明miR-301a和结肠癌的发生具有一定的机制关联。见图1。

图1 实时荧光定量PCR检测结肠癌组织中 miR-301a的表达水平

2.2 实时荧光定量PCR检测HT29细胞过表达和干扰MiR-301a表达效果 对照组miR-301a表达为1.16±0.97，miR-301a前体片段可明显上调HT29细胞中miR-301a的表达水平(3.39±1.04)，同时miR-301a anti-sense片段通过结合降解miR-301a，减少HT29细胞中miR-301a的水平(0.47±0.09)，表明miR-301a前体片段和miR-301a anti-sense片段具有明显的调控表达的效果。

2.3 MTT法检测miR-301a对HT29细胞增殖的影响 miR-301a过表达组HT29细胞数量(5.07±1.31)明显多于对照组(1.15±0.82)，表明miR-301a可能参与促进结肠癌细胞的增殖。同时干扰miR-301a表达的HT29细胞数量(0.42±0.06)则明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，更加明确了miR-301a在HT29细胞增殖中的作用。

2.4 实时荧光定量PCR检测miR-301a对侵袭相关分子表达水平的影响 对照组TGF-β、Smad-4、MMP-9 mRNA表达1.19±0.46，1.12±0.37，1.26±0.52，过表达miR-301a可下调TGF-β、Smad-4 mRNA水平(0.48±0.02，0.43±0.02)，同时上调MMP-9 mRNA的表达(4.98±1.06)，这表明miR-301a可能通过下调TGF-β/ Smad4信号通路，促进MMP-9的表达，最终提高细胞外基质的降解速率，促进癌细胞的侵袭转移。干预组TGF-β、Smad-4、MMP-9 mRNA表达量3.72±1.02，2.51±0.98，0.39±0.01。

3 讨 论

miRNAs是一类保守的、短小的非编码RNA，miRNAs一般全长约19～22个核苷酸，其主要通过转录后调节，即结合靶基因的信使RNA在翻译水平调节靶基因的表达，进而参与调控细胞的增殖、凋亡和分化。此外miRNAs在代谢综合征，各种肿瘤的发病中具有诱导作用，尤其是在肿瘤细胞中，miRNAs可作为癌基因或抑癌基因调控肿瘤的侵袭、转移和血管生成〔9〕。研究显示在乳腺癌以及肺癌肿瘤组织中miRNAs作为抑癌基因，其表达多降低，在结肠癌以及肝癌组织中有些miRNAs作为原癌基因其表达多升高〔10〕。如miR-205可作为脑胶质瘤的一个有价值的生物标志物，促进胶质瘤的侵袭和转移〔11〕；miR-940通过直接调控ZNF24的表达促进胃癌的转移〔12〕。miRNAs作为重要的转录后基因表达的调控者，成为各种细胞过程中的关键调控分子，包括细胞分化、自我更新、细胞增殖和凋亡。研究发现miRNAs通过与靶基因的5′非翻译区相互作用调节靶基因的表达，其可调节超过30%的人类基因转录后的表达调控〔13〕。miRNAs可调控许多组织的癌症进展，研究发现p53突变的肿瘤部分是通过调控miRNAs的表达实现的〔14〕，miR-301a作为癌基因在结肠癌总的致侵袭和致转移的作用目前还不清楚。通过检测人结肠癌组织中miR-301a的表达水平发现结肠癌组织中miR-301a常高表达，同时过表达miR-301a的HT29细胞数目增加，而干扰miR-301a表达的HT29细胞则数目减少。且过表达miR-301a的HT29细胞中Smad-4和MMP-9表达升高，促进结肠癌的侵袭和转移。近期有研究发现，miR-301a可介导Wnt/β-catenin信号在肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移中的作用，β-catenin通过与TCF/LEF基因结合蛋白相互作用，激活含有TCF/LEF元件的miR-301a的表达〔15〕。有研究表明源于肿瘤的miRNA在血液中可免受核糖核酸酶的降解而稳定存在〔16〕。通过本研究发现，miR-301a通过下调SMAD4促进MMP-9的表达水平，最终促进结肠癌细胞的侵袭与转移。基于miR-301a在结肠癌中的作用，因此miR-301a不是为结肠癌侵袭转移的一个有价值的生物预警分子，对结肠癌的分期和预后治疗具有重要的提示意义。

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〔2016-12-22修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

湖北省科技厅资助项目(No.30211176)

徐 虎(1969-)，男，主治医师，主要从事临床外科研究。

R735.3+5

A

1005-9202(2017)08-1825-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.002

1 湖北省肿瘤医院肝胆胰科 2 湖北省人民医院泌尿外科