刘 微， 张 洋， 郭建超， 练鹏影， 吴敏华， 丁文婷

柚皮苷对脑缺血再灌注损伤的保护作用

刘 微， 张 洋， 郭建超， 练鹏影， 吴敏华， 丁文婷

目的 研究柚皮苷(Naringin,NRG)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及星形胶质细胞是否参与其中。方法 柚皮苷连续灌胃7 d后进行大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)，缺血2 h后拔出线栓进行再灌注。24 h后TUNEL染色观察凋亡细胞数量，苏木精-伊红(hematoxyli-eosin,HE)染色观察形态学改变，免疫荧光染色分别检测星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和缝隙连接蛋白43 (connexin43,Cx43)。结果 同模型组相比，柚皮苷预干预后凋亡细胞数量显著减少(P<0.05)，细胞损伤明显减轻。免疫染色显示柚皮苷可以减轻星形胶质细胞的激活程度，同时Cx43的表达也有所降低(P<0.05)。结论 柚皮苷预干预可有效减轻脑缺血再灌注损伤，该保护作用同降低星形胶质细胞Cx43表达密切相关。

柚皮苷； 缺血再灌注； 星形胶质细胞； Cx43

脑血管疾病是威胁人类健康的常见病、多发病，其中缺血性脑血管病发病率高达85%。近年来，大量研究发现星形胶质细胞密切参与脑缺血损伤，逐渐成为治疗脑缺血损伤的重要靶点[1,2]。柚皮苷(Naringin,NRG)属于黄酮类化合物，是从芸香科植物柚中提取出的一种单体。它具有较强的清除自由基、抗氧化和抗炎等保护作用，因此能起到良好的保护血管、预防冠心病的作用[3,4]。最近柚皮苷对脑缺血的保护作用受到日益关注，研究表明柚皮苷可显著降低大鼠脑缺血再灌注损伤侧脑组织含水量,显著缩小脑梗死体积,降低脑组织MDA含量，提高SOD活性[5]。然而星形胶质细胞是否参与柚皮苷对脑缺血的保护作用尚未见报道。本实验采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，通过形态学和凋亡细胞数的观察进一步证实柚皮苷的保护作用，从而形成有效地补充。另外，通过观察柚皮苷对缺血再灌注损伤后星形胶质细胞的激活程度以及Cx43的表达，初步探讨星形胶质细胞在柚皮苷保护中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD 大鼠，雄性，质量250～280 g，由广州中医药大学实验动物中心提供。大鼠术前12 h 禁食不禁水。

1.2 药物与试剂 柚皮苷(Sigma公司)；TUENL检测试剂盒(Roche公司)；GFAP和Cx43分别购自Millipore和Abcam公司。

1.3 主要仪器 冰冻切片机(Leica公司)；OLYMPUS荧光显微镜；Image J 2x图像分析软件。

1.4 动物模型的制备和分组 采用改良的Zea-Longa 线栓法制作局灶性脑缺血大鼠模型。将大鼠腹腔内注射10%水合氯醛( 400 mg/kg) 麻醉后，仰卧固定，颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总及颈内、外动脉，并在颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉。以直径0.26 mm 市售尼龙渔线为线栓，插入颈外动脉残端19～22 mm，阻断大脑中动脉起始端，扎紧结扎线并固定线栓，缺血2 h后拔出线栓。柚皮苷溶于生理盐水，于手术前7 d开始灌胃(80 mg/kg/d)，对照组给予同等量的生理盐水。剔除实验期间死亡及模型制作不成功的大鼠，并及时予以补充。

1.5 HE染色 缺血再灌注24 h后各组大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，插管至升主动脉，用冰冷的生理盐水和4%多聚甲醛进行灌注。取出大脑，依次置于15%和30%蔗糖溶液，然后进行冠状冰冻切片，片厚10 μm，放至-80 ℃备用。行苏木精-伊红( HE) 染色以观察缺血侧海马CA1区神经元病理改变。

1.6 TUNEL染色 采用TUNEL检测试剂盒，按照说明书指南进行操作。Olympus显微镜下观察并照相，计算缺血侧海马CA1区TUNEL阳性细胞数。

1.7 免疫组织荧光染色 脑组织冰冻切片用3% 正常羊血清封闭1 h，随后加入GFAP 抗体( 1∶800)、Cx43(1∶400)，4 ℃孵育过夜，TBST 洗3次后加入荧光二抗，室温避光孵育2 h。漂洗完后Olympus荧光显微镜下观察并照相。采用Image J 图像分析软件测定Cx43阳性面积，计算阳性百分比。

2 结 果

2.1 柚皮苷对海马CA1区凋亡细胞数量的影响 采用TUNEL试剂盒检测凋亡细胞数量。如图所示，同假手术组相比，缺血再灌注使海马CA1区凋亡细胞数量明显增多(P<0.05)，然而柚皮苷预干预使得凋亡细胞数量有所减少(P<0.05)，差异有统计学意义(见图1、表1)。

2.2 柚皮苷对海马CA1区病理学改变的影响 同假手术组相比，模型组神经元受损严重：神经细胞数量减少、排列不规则，胞浆呈嗜酸性变，胞核固缩、破裂、溶解等。与之相比，柚皮苷组神经元损伤有所减轻(见图2)。

2.3 柚皮苷对海马CA1区GFAP染色的影响 同假手术组相比，模型组星形胶质细胞明显被激活：细胞体积变大，突起变粗，GFAP荧光染色强度明显增加；而柚皮苷组星形胶质细胞的激活较模型组减轻(见图3)。

2.4 柚皮苷对海马CA1区Cx43表达的影响 同假手术组相比，缺血再灌注使海马CA1区Cx43表达增加(P<0.05)，经柚皮苷干预后Cx43表达明显偏低(P<0.05)，提示柚皮苷预干预对缺血再灌注损伤导致的Cx43升高有一定的抑制作用(见图4、表1)。

表1 大鼠海马CA1区凋亡细胞数和Cx43阳性 百分比统计

与假手术相比*P<0.05；与模型组相比#P<0.05

3 讨 论

脑缺血具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点，对国民健康造成极大的威胁，已成为严重的社会-医学-经济问题，因此，有关脑缺血预防和治疗的基础研究具有重大的公共健康意义。最近的研究表明柚皮苷可作为缺血性卒中高风险患者潜在的神经保护剂。有文献报道柚皮苷可明显改善脑缺血再灌注导致的神经损伤、减小脑梗死体积和水肿[6]，在本实验中通过TUNEL和HE染色我们观察到柚皮苷预干预可减少凋亡细胞数量，减轻神经细胞受损状态，从形态学上补充了柚皮苷对脑缺血的预保护作用。以前的文献表明，柚皮苷发挥保护作用的机制可能同下调NOD2、RIP2、NF-κB和MMP-9的表达，降低髓过氧化物酶、一氧化氮，抑制炎症以及上调抗氧化状态有关[6,7]。为了进一步明确柚皮苷对脑缺血的保护作用是否有涉及星形胶质细胞，我们首先通过免疫荧光染色观察柚皮苷预干预后星形胶质细胞标记物GFAP的表达。GFAP是星形胶质细胞标记物，它可反映星形胶质细胞的激活程度。本实验研究显示柚皮苷可减轻缺血再灌注损伤对星形胶质细胞的激活，提示星形胶质细胞参与柚皮苷的预保护作用。缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)主要表达于星形胶质细胞，是治疗缺血性卒中药物的重要靶点[8,9]。缝隙连接(gap junction,GJ)可介导电子耦合,允许<1.2 kD和直径<1.5 nm的小分子快速传播，为细胞间物质和信息的传递提供了直接通路。脑缺血早期，缺血中心区的自由基、无氧代谢产物、兴奋性氨基酸以及凋亡启动信号等通过星形胶质细胞GJ向中心区周围、血供相对减少的半暗带(ischemic penumbra，IP)和远离缺血中心的脑组织传播[10]。同时，由于缺血中心区细胞能量很快耗竭，缺血周围如半暗带区细胞内的ATP、葡萄糖、谷胱甘肽以及神经营养因子等营养物质通过GJ 顺着浓度差流向梗死中心区垂死的细胞内[11,12]。缺血损伤比较严重(如缺血2 h，目前临床上脑缺血从发生到治疗的时间往往较长，90%都在2 h以上)时，伤害性因子的扩散作用大于有益因子的扩散作用，脑缺血急性期缝隙连接往往会有扩大损伤的作用[13,14]。我们的实验表明柚皮苷可降低脑缺血再灌注后Cx43的表达，提示柚皮苷可通过下调Cx43减少自由基、无氧代谢产物、兴奋性氨基酸以及凋亡启动信号的扩散从而发挥保护作用。

综上所述，星形胶质细胞在柚皮苷减轻脑缺血损伤过程中发挥重要作用，该研究为探讨柚皮苷抗脑缺血损伤作用机制和临床治疗提供实验依据。

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A:假手术组 B:模型组 C:柚皮苷组

图1 柚皮苷可降低大鼠脑缺血再灌注24 h后的凋亡细胞数量(×400)

A：假手术组 B：模型组 C：柚皮苷组

图2 柚皮苷可减轻大鼠脑缺血再灌注24 h后的细胞损伤(×400)

A：假手术组 B：模型组 C：柚皮苷组

图3 柚皮苷减轻大鼠脑缺血再灌注24 h星形胶质细胞的激活(×400)

A：假手术组 B：模型组 C：柚皮苷组

图4 柚皮苷减轻大鼠脑缺血再灌注24 h 后海马CA1区Cx43的表达(×400)

The protective effect of naringin on cerebral ischemia reperfusion injury

LIUWei,ZHANGYang,GUOJianchao,etal.

(CollegeofFundamentalMedicalScience,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Objective To study the protective effects of naringin on rats with focal cerebral ischemia and reperfusion and whether astrocyte participates in this effect.Methods Naringin group was pretreated intragastricly for consecutive 7 days before ischemia.Middle cerebral artery was occluded for 2 h and then reperfused for 24 h.The number of apoptotic cells was detected by TUNEL staining,and pathological changes were observed by hematoxyli-eosin (HE) staining.Immunofluorescent staining was used to observe astrocytic marker (glial fibrillary detection acidic protein,GFAP) and connexin43 (Cx43).Results Compared with ischemia group,pretreatment with naringin reduced the number of apoptotic cells (P<0.05),and significantly attenuated cell injury.Immunofluorescent staining showed that naringin attenuated astrocytic activation,and decreased the expression of Cx43 (P<0.05).Conclusion Naringin pretreatment can effectively attenuated cerebral ischemia reperfusion injury,and the protective effects are closely related with Cx43 in astrocytes.

Naringin; Ischemia reperfusion; Astrocytes; Cx43

1003-2754(2017)04-0292-03

2016-12-09；

2017-03-30

国家自然科学基金资助项目(No.81202817,81673772)；广东省高等学校优秀青年教师培养项目(No.Yq2013041)；高等学校博士学科点专项科研基金(No.20124425120011)

(广州中医药大学基础医学院，广东 广州 510006)

刘 微，E-mail:weiliu1980@yahoo.com

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