张丹阳，田登梅，刘丽辉，施兵，冯超，何圣科，张永清1,(1河北北方学院，河北张家口075000；解放军第309医院)

慢性髓性白血病患者骨髓单个核细胞SDF-1水平与病情及临床参数的关系

张丹阳1，2，田登梅2，刘丽辉2，施兵2，冯超2，何圣科2，张永清1,2
(1河北北方学院，河北张家口075000；2解放军第309医院)

目的 观察骨髓基质细胞衍生因子1(SDF-1)在慢性髓性白血病(CML)不同病程中的表达，并探讨其与临床参数的关系。方法 选择CML患者30例及健康对照者12例，CML患者30例中，初治慢性期10例、慢性期获得主要分子学反应(MMR)10例(患者接受一代或二代TKI治疗)、急变期10例(接受TKI治疗疾病仍发生进展)。抽取骨髓，提取骨髓单个核细胞，采用实时定量PCR技术检测SDF-1 mRNA，比较CML与健康对照之间及不同病程CML患者之间SDF-1的表达差异，分析SDF-1 mRNA表达水平与CML患者临床参数间的关系。选取上述患者中CML初治慢性期患者6例、急变期4例的骨髓活检标本作为慢性期组及急变期组，并应用5例份无明显病变的骨髓活检标本作为对照组，应用免疫组化技术检测骨髓组织SDF-1蛋白的表达。结果 与健康对照比较，CML初治慢性期患者、急变期患者骨髓单个核细胞SDF-1 mRNA表达水平降低(P均<0.05)，CML慢性期治疗后获得MMR者SDF-1 mRNA水平与健康对照比较，P>0.05；CML急变期患者SDF-1 mRNA表达水平较CML初治慢性期患者高(P<0.05)。急变期组骨髓组织中SDF-1表达阳性率高于慢性期组(P<0.05),慢性期组与对照组比较P>0.05。SDF-1 mRNA低表达(<4.36×10-3)患者外周血白细胞计数高于SDF-1 mRNA高表达(≥4.36×10-3)者(P<0.05)，而SDF-1 mRNA的表达与患者年龄、性别、血红蛋白、血小板计数、CD34+细胞比例、BCR-ABL1/ABL1、染色体核型均无相关性(P均﹥0.05)。结论 CML患者骨髓微环境中SDF-1表达降低，其水平降低与病情加重及白细胞升高有关。

慢性髓性白血病；骨髓基质细胞衍生因子1；急变期

慢性髓性白血病(CML)是髓系造血干细胞恶性克隆性疾病，以髓细胞大量增殖为主要特征。其主要发病机制是Ph染色体t(9；22)(q34；q11)易位导致BCR-ABL融合基因的产生。临床上，CML可分为慢性期、加速期、急变期，酪氨酸抑制剂(TKI)是目前治疗CML的首选用药，对慢性期患者治疗效果良好，但仍有约15%患者在治疗过程中出现耐药，发生进展，预后极差[1]。骨髓微环境中基质细胞衍生因子(SDF-1)与其受体构成的信号转导通路与白血病干细胞的增殖、分化和耐药密切相关[2]。大量研究显示，SDF-1与TKI耐药密切相关，但SDF-1在CML患者中的表达及其与白血病耐药、进展的关系报道较少。本研究应用实时定量PCR和免疫组化法检测了CML患者骨髓微环境中SDF-1表达，并探讨SDF-1在CML不同病程中表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择解放军第309医院2014年3月～2016年9月诊治的CML患者30例，均符合《中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南》[3]中的诊断标准。男19例、女11例，年龄16～67岁。初治慢性期10例、慢性期获得主要分子学反应(MMR)10例(患者接受一代或二代TKI治疗)、急变期10例(接受TKI治疗疾病仍发生进展)。健康对照者12例，男6例、女6例，年龄32～59岁。选取上述患者中CML初治慢性期患者6例、急变期4例的骨髓活检标本作为慢性期组及急变期组，并应用5例份无明显病变的骨髓活检标本作为对照组。

1.2 骨髓单个核细胞SDF-1 mRNA表达水平检测 采用实时荧光定量PCR法。无菌条件下采集CML患者骨髓标本，加入淋巴细胞分离液，提取单个核细胞。以TRIzol(Invitrogen 公司)提取细胞总RNA。紫外分光光度计于OD260 nm和OD280 nm检测RNA浓度及纯度。按日本TAKARA公司PrimeScriptTMRTMaster Mix逆转录试剂盒进行逆转录反应。引物序列：SDF-1上游：5′-ACAGATGCCCATGCCGATTCT-3′，下游：5′-CCTGAATCCACTTTAGCTTCGGGT-3′；GAPDH上游：5′-CTTTTGCGTCGCCAGCCGAG-3′，下游5′-CCAGGCGCCCAATACGACCA-3′。引物由上海生物工程公司合成。扩增完毕后，以GAPDH为内参照基因，与对照组相比。结果采用2-ΔΔCt法计算。

1.3 骨髓活检组织中SDF-1蛋白表达的检测 将骨髓活检标本切3 μm厚切片，采用免疫组化SP法检测，具体操作步骤参照试剂盒说明书，PBS代替一抗作阴性对照。结果判定标准：以细胞膜和细胞质呈黄色或棕黄色为SDF-1表达阳性。阳性细胞百分数<1%为0分，1%～29%为1分，30%～59%为2分，≥60%为3分；细胞质染色无色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项计分相加，0～1分为阴性，≥2分为阳性。

1.4 临床参数的收集及检测方法 收集采髓当日患者的年龄，性别，病程，治疗方案，白细胞、血红蛋白、红细胞计数。流式细胞术检测骨髓中CD34+细胞百分比，PCR检测BCR-ABL融合基因表达、BCR-ABL1/ABL1表达以及患者染色体核型。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。SDF-1 mRNA表达数值以中位数表示，比较采用Mann-WhitneyU秩和检验。组间SDF-1蛋白阳性率比较及SDF-1 mRNA表达与临床参数的关系采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CML患者骨髓单个核细胞SDF-1 mRNA表达水平 CML初治慢性期患者、慢性期MMR患者、急变期患者及健康对照者SDF-1 mRNA表达水平分别为0.162(0.048～22.561)、8.413(4.245～16.402)、1.954(0.104～18.711)×10-3、31.129(3.773～817.902) ×10-3。与健康对照相比，CML急变期、CML初治慢性期患者SDF-1 mRNA表达降低(P均<0.05)；慢性期MMR患者与健康对照比较，P>0.05；CML急变期患者SDF-1 mRNA的表达高于CML初治慢性期患者(P<0.05)。

2.2 CML患者骨髓活检组织中SDF-1蛋白的表达 SDF-1阳性细胞主要分布在骨髓网状组织。慢性期组、急变期组及对照组SDF-1蛋白表达阳性分别为1、4、6例，表达阳性率分别为16.7%、100%、100%，与慢性期组比较，其余两组均升高(P均<0.05)。其余两组间比较，P﹥0.05。

2.3 骨髓单个核细胞中SDF-1 mRNA水平与CML患者临床参数之间的关系 依据患者SDF-1 mRNA中位数水平4.36×10-3，将CML患者分为高表达者(≥4.36×10-3)和低表达者(<4.36×10-3)。SDF-1 mRNA低表达者外周血白细胞计数明显升高(P<0.01)。SDF-1 mRNA表达水平与年龄、性别、血红蛋白、血小板计数、BCR-ABL1/ABL1、染色体异常均无相关性(P均>0.05),详见表1。

表1 CML患者骨髓单个核细胞中SDF-1 mRNA水平与临床参数的关系

3 讨论

SDF-1属CXC类趋化因子，又名为CXCL12，其受体为CXCR4和CXCR7。骨髓微环境中骨髓基质细胞分泌SDF-1结合相应受体后参与造血细胞的生成，白细胞迁移和归巢。近年研究发现，SDF-1/CXCR4轴与白血病的发生和耐药相关。SDF-1可激活STAT5通路的活化，提高白血病细胞的分化、生存能力，导致急性B淋巴细胞白血病的发生[4]。SDF-1/CXCR4信号轴在急性髓白血病细胞与骨髓基质细胞的黏附中发挥重要作用，使其免受化疗药物的细胞毒性作用[5]。SDF-1与CML相关研究多在细胞系和动物模型，发现SDF-1/CXCR4轴在TKI的耐药中起到重要作用[6]。

本研究结果显示，CML初治慢性期患者骨髓单个核细胞SDF-1 mRNA水平和骨髓活检SDF-1表达阳性率较健康对照明显下降。SDF-1 mRNA低水平表达患者外周血白细胞计数明显升高。白血病细胞破坏了正常骨髓微环境，导致细胞因子网络紊乱，SDF-1表达下降[7]。趋化因子SDF-1维持正常造血干细胞的定位、分化，骨髓龛中SDF-1表达水平降低直接参与造血干细胞迁移至骨髓龛外，导致外周血未成熟白细胞大量增殖。经过TKI治疗后获得MMR患者，SDF-1 mRNA表达恢复正常，这可能是CML缓解后瘤负荷降低，SDF-1水平得到恢复。

CML急变期患者SDF-1 mRNA水平和骨髓活检SDF-1表达阳性率均较CML初治慢性期患者升高。这与我们预期的随着疾病发生进展、瘤负荷增加，SDF-1表达进行性降低结果不符。可能存在的原因是本次10例急变期患者均为口服伊马替尼治疗过程中CML进展至急变期。本研究显示患者应用TKI治疗缓解后骨髓单个核细胞SDF-1表达升高。Jin等[8]研究显示，伊马替尼可提高CML细胞表面的CXCR4表达。SDF-1/CXCR4轴介导部分CML细胞迁移至骨髓基质，从而此类CML细胞驻扎于骨髓微环境中，避免伊马替尼的杀伤作用，形成微小残留病灶[9～11]。此类CML细胞进一步分化扩增，导致疾病进入急变期。因此，我们推测SDF-1升高在CML耐药进展中起到重要作用。本研究中，急变期组SDF-1蛋白阳性表达率与对照组相同，考虑到本次实验骨髓活检标本例数少，且免疫组化为定性研究，急变期患者SDF-1 mRNA定量表达明显低于健康对照者，并不能说明急变期患者SDF-1升高到正常水平。CML急变期患者SDF-1水平低于健康对照者仍需扩大实验样本证实。

综上所述，CML患者骨髓微环境中SDF-1分泌减少，治疗获得MMR后SDF-1 mRNA水平恢复。CML初治慢性期患者SDF-1水平降低与CML发病和外周血白细胞计数升高密切相关。SDF-1在TKI耐药、CML进展中具有一定作用，但其具体分子机制及表达上调的调控因素可能与其他细胞因子、信号通路的相关作用有关[10]，有待进一步研究。

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张永清(E-mail: zhangyongqing0725@163.com)

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2016-11-14)