张德保，邢春根 (苏州大学附属第二医院，江苏苏州215000)

·论著·

长链非编码RNA SPRY4-IT1 对结直肠癌细胞HT-29 增殖凋亡的影响及机制

张德保，邢春根
(苏州大学附属第二医院，江苏苏州215000)

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA) SPRY4-IT1对结直肠癌细胞HT-29增殖、凋亡的影响及机制。方法 采用qRT-PCR方法检测LncRNA SPRY4-IT1在结直肠癌细胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)和正常肠上皮细胞(FHC)的表达。选择其相对表达最高的HT-29细胞，以慢病毒载体介导构建SPRY4-IT1过表达(上调组)和干扰的(下调组)稳转细胞株，并设立无义转染组和空白对照组；qRT-PCR检测各组HT-29细胞中SPRY4-IT1 mRNA的表达量；CCK-8法检测细胞增殖活力；克隆试验检测细胞的克隆形成率；流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期。Western blotting法检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达量。结果 LncRNA SPRY4-IT1在结直肠细胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)相对FHC的表达增高，以HT-29细胞株中的表达最高(P均<0.05)。相对于空白对照组、无义转染组，上调组SPRY4-IT1 mRNA表达量升高，HT-29细胞增殖活力增强，克隆形成率升高，凋亡率降低(P<0.05或<0.01)；而下调组SPRY4-IT1 mRNA表达量下降，细胞增殖活力减弱，克隆形成率降低，凋亡率升高(P<0.05或<0.01)；在各组细胞间，细胞周期分布比较，P均>0.05。相对于空白对照组、无义转染组，上调组细胞Bcl-2蛋白表达量增多，Bax蛋白表达量减少(P<0.05或<0.01)；下调组Bcl-2蛋白表达量减少，Bax蛋白表达量增多(P均<0.01)。结论 LncRNA SPRY4-IT1可能通过促进Bcl-2表达，抑制Bax表达而促进结直肠癌细胞增殖、抑制其凋亡。

结直肠癌细胞HT-29；长链非编码RNA；SPRY4-IT1；细胞增殖；细胞凋亡

长链非编码RNA(LncRNA)是指长度超过200个核苷酸，不具有蛋白质编码功能的RNA。早年研究认为，LncRNA是转录后的“暗物质”或“噪音”[1,2]。近年研究证实，LncRNA虽不编码蛋白质，可以和蛋白质相互作用[3]，并参与细胞分化过程的调节，在干细胞的生长、凋亡和肿瘤细胞的转移中发挥着重要作用[4,5]。在结直肠癌的发生、发展中发挥着重要作用的LncRNA有BRAF-actived LncRNA(BANCR)、LncRNA HOTAIR、LncRNA MALAT1、LncRNA-CCAT1等[6～9]。有研究表明，LncRNA SPRY4-IT1在黑色素瘤、脑胶质瘤、食管癌、胃癌、肾透明细胞癌、膀胱癌中均有报道[10～15]，与肿瘤的发生、发展及预后具有一定的相关性。2016年5～12月，本研究主要探讨了LncRNA SPRY4-IT1在结直肠癌细胞株中的表达，以及SPRY4-IT1对HT-29细胞增殖、凋亡的影响，为将来结直肠癌临床分子靶向诊断和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人结直肠癌细胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)和正常人肠上皮细胞(FHC)均购于中国科学院上海细胞库。RPMI-1640、胎牛血清购自美国Gibco公司。SPRY4-IT1引物序列、内参GAPDH引物购自上海生工。过表达和干扰序列由南京Abm公司合成。CCK-8试剂盒购自日本同仁；7-aad/PE试剂盒购自BD公司；细胞周期与细胞凋亡试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天；Bax、Bcl-2抗体(兔抗人)购自Abcam公司，β-actin内参(鼠抗人)及抗兔、抗鼠二抗购自碧云天。BioRad CFX96 Touch 荧光定量PCR仪购自美国BioRad公司；TECAN Infinite 200 Pro多功能酶标仪购自瑞士；恒压恒流电泳仪购自美国Bio-RAD公司；电泳仪和电泳槽购自中国上海辉煌科学仪器公司；化学发光成像系统购自中国基因有限公司。

1.2 细胞培养 用含10%已灭活的胎牛血清及1%青链霉素RPMI1640培养基培养结直肠癌细胞株(HT-29、HCT-116、SW-480、SW-620、Caco-2)及FHC。根据培养基的颜色每2～3 d换液一次，待细胞融合至90%左右，进行细胞传代，并取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 LncRNA SPRY4-IT1 mRNA的检测 采用qRT-PCR法。TRIzol法抽提总RNA，逆转录合成cDNA。qRT-PCR：所有cDNA样品分别配制内参和目的基因的实时定量PCR反应体系。每个反应管配置3个复孔，并设计阴性对照，即反应体系中以去离子水代替模板cDNA。将配制好的PCR反应溶液置于qPCR仪上进行qPCR扩增反应。反应条件：95 ℃ 2 min预变性，然后按95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s(收集荧光信号)，72 ℃ 30 s,共45个循环，反应结束后设置熔解曲线分析程序。所用引物序列如下：SPRY4-IT1(上游引物：5′-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3′，下游引物：5′-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3′);内参GAPDH引物(上游引物：5′-GACTCATGACCACAAGTCCATGC-3′，下游引物：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′)。采用2-ΔΔCT法分析LncRNA SPRY4-IT1的相对表达。

1.4 稳转细胞株的构建及分组 以慢病毒载体介导构建SPRY4-IT1过表达、敲低及无义序列的稳转细胞株，慢病毒载体及稳转细胞株由南京Abm公司合成并构建。将细胞分为上调组(SPRY4-IT1过表达的稳转细胞株)、下调组(SPRY4-IT1敲低的稳转细胞株)及无义转染组(无义转染的细胞株)，设置空白对照组。干扰序列为：CCCAGATGTTGACAGCTGCCTCT。用qRT-PCR法检测各组HT-29细胞中SPRY4-IT1的相对表达，方法和反应条件同1.3。

1.5 细胞增殖活力的检测 采用CCK-8法。取对数生长期胰酶消化悬浮细胞，调整细胞为104/mL,取100 μL加入96孔板，继续培养24 h。每组细胞设3个复孔，并设阴性对照(只加培养基和CCK-8，没有细胞)。分别于细胞接种到96孔板后的第1天至第5天加CCK-8液10 μL,于加液后继续正常培养4 h，在酶标仪上450 nm波长处测定每孔吸光度(OD)值。

1.6 细胞克隆形成能力的检测 采用克隆形成试验。取对数生长期各组HT-29细胞，胰酶消化细胞，培养基悬浮细胞，细胞计数板计数，用6孔板培养，每孔加300个细胞，加含10%胎牛血清1640培养基至3 mL。细胞在标准条件下，培养2～3周，3～5 d换液一次，观察克隆形成，以肉眼可见克隆时终止培养。弃培养基，用PBS清洗2次，每孔加甲醇1 mL固定15 min。弃固定液，用姬姆萨染液染色30 min。每组细胞接种3个复孔。计算克隆形成率，克隆形成率=克隆数目/接种细胞数×100%。

1.7 细胞凋亡率及细胞周期的检测 采用流式细胞术。细胞凋亡率的检测：取对数生长期各组HT-29细胞，用胰酶消化，培养基悬浮,取1×105～5×105个细胞用PBS洗涤2次(1 000 r/min离心5 min),加Binding Buffer 100 μL悬浮细胞，每管中加7-aad 5 μL和PE染料5 μL，再加Binding Buffer 400 μL混匀。同时，设空白对照(不加染料)，单染管(分别用7-aad 5 μL和PE 5 μL染料)室温避光反应15 min。进行流式细胞凋亡率检测，结果用总凋亡的百分比表示。细胞周期的检测：取对数生长期各组HT-29细胞，用胰酶消化，培养基悬浮,取1×105～5×105个细胞用PBS洗涤2次(1 000 r/min离心5 min),弃上清，用PBS 0.5 mL重悬细胞， 70%乙醇5 mL固定，4 ℃过夜。1 000 r/min,离心15 min,弃上清，用PBS洗涤2次,弃上清，加缓冲液500 μL，加RNase 10 μL,37 ℃水浴30 min,加PI 25 μL,避光反应30 min，进行流式细胞周期检测。

1.8 各组HT-29细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达量的检测 采用Western blotting法。取对数生长期各组HT-29细胞，弃培养基，用PBS清洗两遍，配制含抑制剂的蛋白抽提试剂(RIPA抽提试剂1 mL中加入蛋白酶抑制剂PMSF 10 μL),1×106～5×106个细胞,轻轻摇动5 min，用细胞刮将贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液至离心管中，12 000 r/min离心15 min，取上清，即为所提的蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，根据标准蛋白BSA曲线计算目的蛋白浓度，5×蛋白上样缓冲液SDS-PAGE 50 μL加目的蛋白200 μL，95 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存或后续实验。按比例配制12%分离胶和5%浓缩胶，根据目的蛋白浓度加上样量，跑电泳→转膜→封闭→孵一抗过夜→回收一抗→洗膜(10 min×4次)→孵二抗(1 h)→洗膜(10 min×4次)→ECL化学成像发光，观察目的蛋白表达。用目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

2 结果

2.1 结直肠癌细胞株和FHC中SPRY4-IT1 mRNA的表达量比较 FHC、HT-29、HCT-116、SW480、SW620、Caco-2细胞株中SPRY4-IT1 mRNA的表达量分别为1.00、36.76±7.98、4.49±0.38、19.88±4.88、15.46±3.30、8.81±1.81。相对于FHC，其他细胞中的表达均升高，以HT-29细胞株为著(P均<0.05)。

2.2 各组细胞中SPRY4-IT1 mRNA的表达量比较 上调组、下调组、空白对照组、无义转染组SPRY4-IT1 mRNA的表达量分别为5.81±0.33、0.24±0.03、1.00、1.03±0.04，相对于无义转染组、空白对照组，上调组SPRY4-IT1 mRNA表达量升高(P均<0.01)，下调组SPRY4-IT1 mRNA表达量下降(P均<0.01)；无义转染组、空白对照组比较，P>0.05。

2.3 各组细胞增殖活力的比较 上调组、下调组、无义转染组、空白对照组第1、2、3、4、5天OD值分别为0.45±0.01、0.85±0.01、1.19±0.01、2.15±0.02、2.52±0.02，0.44±0.01、0.60±0.01、0.62±0.01、0.65±0.01、0.82±0.01，0.46±0.01、0.66±0.01、0.77±0.03、1.12±0.02、1.23±0.03，0.45±0.03、0.66±0.01、0.77±0.03、1.18±0.01、1.28±0.01。相对于无义转染组、空白对照组，除第1天外，其余各时间上调组细胞增殖活力增强(P均<0.01)，下调组细胞增殖活力下降(P均<0.05)；无义转染组、空白对照组比较，P均>0.05。

2.4 各组细胞克隆形成率比较 上调组、下调组、无义转染组、空白对照组克隆形成率分别为61.67%±2.91%、13.00%±1.16%、28.33%±1.76%、30.33%±1.67%。相对于无义转染组、空白对照组，上调组细胞克隆形成率升高(P均<0.01)，下调组细胞克隆形成率下降(P均<0.01)；无义转染组、空白对照组比较，P>0.05。

2.5 各组细胞凋亡率比较 上调组、下调组、无义转染组、空白对照组总凋亡率分别为0.69%±0.08%、3.34%±0.21%、1.60%±0.22%、1.29%±0.16%。相对于无义转染组、空白对照组，上调组细胞凋亡率降低(P均<0.05)，下调组细胞凋亡率升高(P均<0.01)；无义转染组、空白对照组比较，P﹥0.05。

2.6 各组细胞周期比较 上调组细胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占百分比分别为77.20%±0.81%、6.93%±0.51%、13.76%±0.36%，下调组分别为71.41%±0.99%、12.86%±1.24%、13.53%±1.76%，无义转染组分别为73.93%±1.20%、10.62%±1.01%、15.01%±0.60%，空白对照组分别为72.98%±0.44%、10.77%±0.46%、13.25%±0.44%。各组之间各期细胞所占百分比比较，P均﹥0.05。

2.7 各组Bcl-2、Bax蛋白表达量比较 上调组、下调组、无义转染组、空白对照组Bcl-2蛋白表达量分别为1.31±0.07、0.37±0.03、0.70土0.01、0.71±0.09，Bax蛋白表达量分别为0.51±0.01、1.42±0.05、0.82±0.01、0.71±0.02。相对于空白对照组、无义转染组，上调组Bcl-2蛋白表达量增多(P均<0.01)，Bax蛋白表达量减少(P均<0.01)；下调组Bcl-2蛋白表达量减少(P均<0.05)，Bax蛋白表达量增多(P均<0.01)；无义转染组、空白对照组比较，P均﹥0.05。

3 讨论

研究发现,LncRNA参与肿瘤的发生、发展，影响肿瘤患者的治疗及预后，调节肿瘤细胞的增殖、迁移及凋亡等过程,但众多LncRNA的生物学功能及其作用机制仍不是很清晰，需要进一步研究。LncRNA SPRY4-IT1是Sprouty4内含子转录本1，长度为687个核苷酸，其基因库编码：GC05M142318，位于5q31.3,源自于Sprouty4基因。Khaitan等[10]在2011年首次报道SPRY4-IT1在黑色素瘤细胞中的高表达，并调节黑色素瘤细胞的凋亡和迁移。本研究发现，SPRY4-IT1在结直肠癌细胞株HT-29中相对表达最高。上调HT-29细胞SPRY4-IT1的表达，促进细胞增殖和克隆形成，抑制其凋亡；而下调SPRY4-IT1的表达抑制HT-29的增殖和克隆形成，促进其凋亡。B淋巴细胞瘤-2基因简称Bcl-2,是细胞凋亡研究中最受重视的基因，它具有抑制凋亡的作用，此外Bcl-2可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗作用；Bax是另一类与凋亡相关的蛋白因子，主要表现为促进细胞凋亡的作用。上调HT-29细胞SPRY4-IT1的表达，可促进Bcl-2的表达，抑制Bax表达，从而抑制了细胞凋亡；下调HT-29细胞SPRY4-IT1的表达，可抑制Bcl-2表达，促进Bax表达，从而促进了细胞凋亡。因此，我们认为SPRY4-IT1在结直肠癌细胞中表现为癌基因特性，敲低HT-29细胞中SPRY4-IT1的表达，通过调节凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2能抑制结直肠癌细胞的生长和增殖，促进其凋亡，为将来结直肠癌临床诊断和分子靶向治疗提供理论依据，SPRY4-IT1有可能成为结直肠癌分子靶向治疗重要靶点。

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Influence of long non-coding RNA SPRY4-IT1 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells HT-29

ZHANGDebao,XINGChungen

(TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,China)

Objective To explore the influence and mechanism of long non-coding RNA (Lnc RNA) SPRY4-IT1 on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells HT-29. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was performed to detect the expression of LncRNA SPRY4-IT1 in the colorectal cancer cell lines (HT-29, HCT-116, SW-480, SW-620, Caco-2) and the normal intestinal epithelial cell line FHC. We selected HT-29 cells with the relative highest expression of SPRY4-IT1 for this study. Lentivirus-mediated recombinant plasmid target SPRY4-IT1 was constructed and transfected into colorectal cancer HT-29 cells to establish the stably transfection cells of over-expression (up-regulation group) and interference (knock-down group). Meanwhile, the negative control group and blank control group were established. qRT-PCR was used to detect the expression of SPRY4-IT1 mRNA in HT-29 cells of each group. CCK-8 was applied to detect the proliferation of HT-29. cells Clone formation assay was used to test the colony forming efficincy of HT-29 cells. Flow cytometry was applied to detect the apoptosis and cell cycle of HT-29 cells. Western blotting was used to testify the expression of Bax and Bcl-2.Results The relative expression of LncRNA SPRY4-IT1 in colorectal cancer cell lines (HT-29, HCT-116, SW-480, SW-620, Caco-2) was significantly higher than that in the normal intestinal epithelial cell line FHC, and the expression of SPRY4-IT1 was the highest in HT-29 cells (allP<0.05). Compared with the negative control group and blank control group, the expression of SPRY4-IT1 mRNA, the proliferation and the colony forming efficincy of HT-29 cells in the up-regulation group were enhanced, and apoptosis rate was decreased (P<0.05 orP<0.01), and the opposite trend was observed in the knock-down group (P<0.05 orP<0.01). There was no significant difference in cell cycle of HT-29 cells among these groups (allP>0.05). Compared with the negative control group and blank control group, the expression of Bcl-2 was increased and Bax was decreased in HT-29 cells of the up-regulation group (P<0.05 orP<0.01), the expression of Bcl-2 was decreased and Bax was increased in HT-29 cells of the knock-down group (allP<0.01). Conclusion LncRNA SPRY4-IT1 may significantly accelerate proliferation and restrain apoptosis of colorectal cancer cell via promoting the expression of Bax and depressing the expression of Bcl-2.

colorectal cancer cells HT-29; long non-coding RNA; SPRY4-IT1; cell proliferation; apoptosis

国家自然科学基金资助项目(81672970)。

张德保(1979-)，男，硕士研究生在读，主要研究方向为普外科胃肠道疾病。E-mail：18706202833@163.com

邢春根(1965-)，男，主任医师(教授)，主要研究方向为普外科胃肠道肿瘤。E-mail:xingcg@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.001

R735.3

A

1002-266X(2017)13-0001-04

2017-01-12)