郑秀平，丁豪杰，郭筱璐，杨怡，黄艳，陈学秋，周前进，杜爱芳

（1浙江大学动物科学学院/浙江省动物预防医学重点实验室，杭州 310058；2宁波大学生物技术系，浙江宁波 315211）

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

郑秀平1，丁豪杰1，郭筱璐1，杨怡1，黄艳1，陈学秋1，周前进2，杜爱芳1

（1浙江大学动物科学学院/浙江省动物预防医学重点实验室，杭州 310058；2宁波大学生物技术系，浙江宁波 315211）

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一，该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性，对其基因进行了克隆、原核表达，并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H. contortus ZJ株daf-22 cDNA序列（GenBank：HQ738470.1）设计特异性引物，克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22， 经测序鉴定正确后将其转化E. coli BL21，经终浓度为0.1 m mol·L-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h，离心菌液，50 mmol·L-1浓度的PBS溶液重悬菌体溶液，冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22，并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分，并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA（AcAc-CoA）分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性，酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为（50 mmol·L-1Tris-Cl pH 8.1，20 mmol·L-1MgCl2，60 μmol·L-1CoA，10 μmol·L-1AcAc-CoA，加入约0.1 μg蛋白），通过记录反应过程中由于底物（AcAc-CoA）的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化，从而计算出硫解反应的初始反应速率，最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。……