黄晓春，吕茉琦，杜良智，任文娟，周党侠

(1.西安市第四医院妇产科，陕西 西安 710004；2.西安交通大学医学部病理系，陕西 西安 710061；3.西安交通大学医学部生殖医学中心，陕西 西安 710061)

HLA-DRB1基因多态性与陕西汉族妇女患中重度EM风险的相关性

黄晓春1，吕茉琦2,3，杜良智2,3，任文娟2,3，周党侠2,3

(1.西安市第四医院妇产科，陕西 西安 710004；2.西安交通大学医学部病理系，陕西 西安 710061；3.西安交通大学医学部生殖医学中心，陕西 西安 710061)

目的 探讨HLA-DRB1基因多态性在陕西汉族中重度子宫内膜异位症(EM)人群中的分布及其与EM发病风险的关联性。方法 采用聚合酶链反应-直接测序技术(PCR-SBT)，检测50例中重度EM患者和52例正常对照人群中HLA-DRB1的基因多态性分型，分析其基因型分布及其与中重度EM发病风险的相关性。结果 HLA-DRB1基因在EM组和对照组人群中均呈高度多态性分布；EM组人群中检测到22种HLA-DRB1基因型，其中基因型频率大于5%分别为HLA-DRB1*07:01(18%)，DRB1*15:01(12%)，DRB1*09:01(11%)，DRB1*12:01(7%)，DRB1*12:02(7%)，DRB1*14:54(6%)，DRB1*15:02(6%)和DRB1*14:05(5%)。在对照组中人群中检测到24种HLA-DRB1基因型，其中基因型频率大于5%分别为HLA-DRB1*15:01(16.3%)，DRB1*07:01(14.4%)，DRB1*12:02(8.7%)，DRB1*12:01(8.7%)，DRB1*09:01(6.7%)和DRB1*04:05(5.8%)。HLA-DRB1各基因型在EM组与对照组中的分布未见明显统计学差异。结论 HLA-DRB1基因多态性与陕西汉族中重度EM发病风险无明显关联。

HLA-DRB1基因；子宫内膜异位症；基因多态性；聚合酶链反应-直接测序技术

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)是女性常见病和多发病，发病率高达10%～15%，近年来发病有逐渐上升的趋势[1]。EM临床主要表现为痛经、不规则阴道流血和不孕等，病情严重则影响妇女的身心健康。目前EM发生的确切病因和发病机制不明。当前关于EM的发病机制有很多学说，包括：子宫内膜种植学说、体腔上皮化生学说及免疫学说等。近年来，越来越多的证据表明EM是一种自身免疫性疾病[2-3]。

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是一种高度多态性和具有多种免疫功能的基因系统，HLA-DR抗原是HLA系统最重要的抗原之一，决定其特异性的主要编码基因DRB1座位具有高度多态性，许多自身免疫性疾病都与其相关[4-5]。本研究将采用先进的聚合酶链反应-直接测序(polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT)技术，对经过临床严格筛选的EM患者进行HLA-DRB1等位基因的基因分型，探讨EM患者的遗传易感性与HLA-DRB1的相关性。

1资料与方法

1.1研究对象

方法[5]，选择2011年3月至2015年12月在西安市第四医院收治的EM患者50例，均为在陕西地区居住的汉族，年龄22～43岁。按美国生育协会(AFS)修正标准分期均为Ⅲ～Ⅳ期，均经手术后病理检查证实。正常对照组为前来西安市第四医院体检的健康女性，月经规律，无痛经史，均曾足月分娩，陕西汉族，年龄28～41岁。入选EM患者和对照组均被告知研究目的、方法和意义，并签署知情同意书。本研究方案经西安交通大学医学伦理委员会审批通过。

1.2全血基因组DNA提取

采集外周静脉血3mL于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，放置于-20℃冰箱保存备用。全血基因组DNA提取按照全血DNA提取试剂盒说明书(北京鼎国生物技术有限公司)进行。

1.3 HLA-DRB1基因分型

HLA-DRB1基因多态性检测采用PCR-SBT，严格按照试剂盒说明书进行(SeCoreTM， Invitrogen)，扩增包括DRB1第2外显子和其两端的部分内含子序列，扩增条件：96℃2min后，96℃30s；60℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10min。将得到的PCR产物纯化后在ABI-3730XL 测序仪上进行测序。

1.4统计学方法

首先，利用Arlequin 3.5软件(Laurent Excoffier，伯尔尼大学，瑞士)计算Hardy-Weinberg平衡；其次，利用PowerStat Version1.2软件计算HLA-DRB1位点的观察杂合度(homozygotes，Ho)、期望杂合度(heterozygotes，He)、多态信息量(polymorphism information content，PIC)、匹配概率(Pm)、个体识别率(power of discrimination，PD)和非父排除率(PPE)等。最后，HLA-DRB1位点基因多态性在EM患者和对照组间的分布差异采用Chi-square检验和Fisher精确检验，比值比(OR)及95%可信区间(95%CI)利用Logistic回归模型计算，P值用Bonferroni校正(Pc)，以Pc<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡

2.2 HLA-DRB1的基因参数

观察EM组和对照组人群HLA-DRB1基因的Ho、He、PIC、Pm、PD、PPE，这些基因参数信息常用来评估基因多态性。当PD值大于0.8，PIC值大于0.5或者PPE值大于0.5均表明此基因是高度多态性的。

由表1可见，HLA-DRB1基因在EM组和对照组人群中的基因参数包括PD、PIC和PPE值均高于临界值，说明HLA-DRB1基因在EM组和对照组人群中呈高度多态性分布。

表1 EM患者和对照组中HLA-DRB1基因的参数信息

Table1 Genetic parameters of HLA-DRB1 locus in EM patients and controls

2.3 HLA-DRB1基因型分布

如表2所见，在50例EM患者中检测到22种HLA-DRB1基因型，其中基因型频率大于5%的分别为HLA-DRB1*07:01(18%)，DRB1*15:01(12%)，DRB1*09:01(11%)，DRB1*12:01(7%)，DRB1*12:02(7%)，DRB1*14:54(6%)，DRB1*15:02(6%)和DRB1*14:05(5%)。

在52例对照组中检测到24种HLA-DRB1基因型，其中基因型频率大于5%的分别为HLA-DRB1*15:01(16.3%)，DRB1*07:01(14.4%)，DRB1*12:02(8.7%)，DRB1*12:01(8.7%)，DRB1*09:01(6.7%)和DRB1*04:05(5.8%)。

The simulative research of campus network based on OPNET

2.4 HLA-DRB1基因型频率与EM易感性的关系

由表2可见，HLA-DRB1各基因型分布在EM患者与对照组中比较差异无统计学意义(均P>0.05)。虽然EM组HLA-DRB1*14:54基因型是对照组的6.574倍(95%CI0.777～55.622)，但经过Bonferroni校正，差异没有统计学意义。

表2 高分辨率HLA-DRB1基因型在病例与对照组中的分布及其与EM易感的相关性

(转下表)

(续上表)

HLA-DRB1对照组(n=104alleles)EM患者(n=100alleles)NAF(%)NAF(%)PPcOR(95%CI)11:0432.911.00.332NS0.340(0.035～3.325)12:0198.777.00.660NS0.795(0.284～2.222)12:0298.777.00.660NS0.795(0.284～2.222)13:0132.911.00.332NS0.340(0.035～3.325)13:0221.911.00.584NS0.515(0.046～5.772)13:0311.0-----14:0311.011.00.978NS1.040(0.064～16.863)14:0421.911.01.000NS0.515(0.046～5.772)14:0532.955.00.436NS1.772(0.412～7.618)14:541166.00.061NS6.574(0.777～55.622)15:011716.31212.00.374NS0.698(0.315～1.547)15:0232.966.00.325NS2.149(0.523～8.839)16:021111.01.000NS1.040(0.064～16.863)

注：N为等位基因数，AF为等位基因频率(allele frequency)，NS为无统计学意义(not significant)，Pc为校正P值(Pvalue corrected by 26)， “-”表示缺失值，EM组或对照组未出现此等位基因，因此未作统计学比较。

3讨论

3.1 HLA基因多态性

HLA基因位于第6号染色体短臂6p21.31区，长3 600kb，是一个由一系列紧密连锁的基因座位所组成的具有高度多态性的复合体，也是目前所知人体内最复杂的遗传多态系统[5-6]。根据最新的数据库结果(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)，目前已确定的HLA等位基因达14 473个，其中DRB1位点1 883个。其高度多态性使得其成为最重要的疾病易感基因之一[7-8]。

3.2 HLA-DRB1基因多态性与EM的易感相关性

本研究首次应用最先进的PCR-SBT技术探索HLA-DRB1基因在EM患者中的分布及其与EM的易感联系。结果显示EM组和对照组人群之间HLA-DRB1等位基因频率比较差异无统计学意义。HLA-DRB1等位基因多态性与陕西汉族女性人群的EM可能无明显相关性。

EM被认为是一种多因素遗传病[9]，其发病与自身免疫密切相关[10]。在盆腔异位子宫内膜病灶或逆流经血中子宫内膜碎片的刺激下，产生一系列的活化因子而启动免疫反应，导致腹腔液微环境改变，使“逃逸”在腹腔的内膜异位种植并生长。Sundqvist等[11]研究发现HLA-DRB1的rs660895位点是中重度EM的易感多态性位点，但我国学者宗利丽等于2001年的研究发现中国南方妇女EM与HLA-DRB1等位基因可能无相关性。本研究结论也认为位于中国西部的陕西汉族妇女中重度EM与HLA-DRB1等位基因可能无相关性。这些研究结果的不一致可能归因于不一样的HLA分型方法、样本尺寸、民族背景和地理差异[5,11]。

3.3影响实验结果的相关因素分析

HLA分型方法、样本大小及民族地理差异是影响实验结果的重要因素。目前HLA分型方法主要有序列特异性寡核苷酸探针(PCR-sequence specific oligonu-cleotide probing，PCR-SSOP)、序列特异性引物(PCR- sequence specific primers，PCR-SSP)和PCR-SBT。其中PCR-SBT对HLA等位基因的碱基序列进行直接测定，是目前HLA分型最直接、最准确的方法，被公认为HLA检测分型的金标准。本研究首次应用最先进的PCR-SBT技术研究HLA-DRB1基因在EM患者中的分布及其易感性，结果显示EM组和对照组人群之间HLA-DRB1等位基因频率比较差异无统计学意义。位于中国西部的陕西汉族女性人群EM与HLA-DRB1等位基因可能无明显相关性。在样本选择方面，本研究采用经过临床严格筛选的中重度EM患者进行HLA-DRB1等位基因的基因分型，更能反映基因—疾病的相关性。此外，陕西地区是中华文明的发源地之一，是汉族的主要聚居区之一，陕西地区汉族人群的基因特征是中华民族汉族人群的重要分支和基础。本研究的病例对照人群均选择陕西汉族女性，也排除了民族地理差异对实验结果的影响。

3.4结论与展望

综上，本研究结果显示陕西汉族女性人群EM与HLA-DRB1等位基因可能无明显相关性，但HLA的多态性在不同民族、地域的人群中分布差异很大，而且某些疾病易感基因可能不是单一位点的等位基因，而是多个等位基因组成的单倍体，因此在后续的研究中，我们需要进一步加大样本观察，为寻找EM的易感基因提供更有价值的线索和依据。

[参考文献]

[1]Bellelis P,Podgaec S,Abrão M S.Environmental factors and endometriosis[J].Rev Assoc Med Bras(1992),2011,57(4):448-452.

[2]Ahn S H,Singh V,Tayade C.Biomarkers in endometriosis: challenges and opportunities[J].Fertil Steril,2017,107(3):523-532.

[4]Furukawa H,Oka S,Tsuchiya N,etal.The role of common protective alleles HLA-DRB1*13 among systemic autoimmune diseases [J]. Genes Immun, 2017,18(1):1-7.

[5]Zhou D X,Wang X F,Wang X F,etal.Association study of human leucocyte antigen-A gene with idiopathic male infertility in Han population of China[J].Andrologia,2012,44(suppl 1):213-218.

[6]Zhou D X,Zhang J,Wang H X,etal.Association study of HLA-B alleles with idiopathic male infertility in Han population of China[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(10):979-985.

[7]Hollenbach J A,Oksenberg J R.The immunogenetics of multiple sclerosis:a comprehensive review[J].J Autoimmun,2015,64:13-25.

[8]Li C P,Zhou Y,Xiang X,etal.Relationship of HLA-DRB1 gene polymorphism with susceptibility to pulmonary tuberculosis: updated meta-analysis[J].Int J Tuberc Lung Dis,2015,19(7):841-849.

[9]马志华,高尚风.小分子RNA在子宫内膜异位症中的研究进展[J].中国妇幼健康研究,2016,27(4):546-549.

[10]吴玉萍,彭静,方晏平.趋化因子在子宫内膜异位症患者中的表达及临床意义[J].中国妇幼健康研究,2015,26(3):501-503.

[11]Sundqvist J,Falconer H,Seddighzadeh M,etal.Endometriosis and autoimmune disease: association of susceptibility to moderate/severe endometriosis with CCL21 and HLA-DRB1[J].Fertil Steril,2011,95(1):437-440.

[专业责任编辑：王月玲]

Association of HLA-DRB1 gene polymorphism with moderate to severe endometriosis in females of Han nationality in Shaanxi Province

HUANG Xiao-chun1, LYU Mo-qi2,3, DU Liang-zhi2,3, REN Wen-juan2,3, ZHOU Dang-xia2,3

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FourthHospitalofXi’anCity,ShaanxiXi’an710004,China; 2.DepartmentofPathology,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,ShaanxiXi’an710061,China; 3.ReproductiveMedicineCenter,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To investigate the distribution of HLA-DRB1 gene polymorphism in females of Han nationality with moderate to severe endometriosis (EM) in Shaanxi Province and its association with EM risk. Methods Polymerase chain reaction sequence-based typing (PCR-SBT) method was used for DNA genotyping at HLA-DRB1 locus in 50 patients with moderate to severe EM and 52 healthy controls in females to analyze the association between genotype distribution of HLA-DRB1 alleles and risk of moderate to severe EM. Results Both in EM group and control group HLA-DRB1 appeared highly polymorphic. Twenty-two HLA-DRB1 alleles were detected in EM group, and the frequency of following genotypes was above 5%, HLA-DRB1*07:01 (18%), DRB1*15:01(12%), DRB1*09:01(11%), DRB1*12:01 (7%), DRB1*12:02 (7%), DRB1*14:54 (6%), DRB1*15:02 (6%) and DRB1*14:05 (5%). Twenty-four HLA-DRB1 alleles were detected in control group, and the frequency of following genotype was above 5%, HLA-DRB1*15:01 (16.3%), DRB1*07:01 (14.4%), DRB1*12:02 (8.7%), DRB1*12:01 (8.7%), DRB1*09:01 (6.7%) and DRB1*04:05 (5.8%). However, no significant differences in these allelic frequencies were found between EM group and control group. Conclusion HLA-DRB1 gene polymorphism does not significantly associated with risk of moderate to severe EM in females of Han nationality in Shaanxi Province.

HLA-DRB1 gene; endometriosis (EM); gene polymorphism; polymerase chain reaction sequence-based typing (PCR-SBT)

2016-10-05

黄晓春(1970-)，女，副主任医师，主要从事妇科诊疗工作。

周党侠，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.03.016

R173

A

1673-5293(2017)03-0270-04