曹丽琼，蒋惠玲，阿米娜，易金玲

(新疆医科大学第五附属医院产科，新疆 乌鲁木齐 830000)

IL-10、TNF-α及SOCS3在妊娠期肝内胆汁淤积症母胎界面的变化

曹丽琼，蒋惠玲，阿米娜，易金玲

(新疆医科大学第五附属医院产科，新疆 乌鲁木齐 830000)

目的 探讨白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及细胞因子信号转导抑制子3(SOCS3)在妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)母胎界面的变化。方法 选取新疆医科大学第五附属医院2013年10月至2016年10月ICP孕妇43例作为观察组，选择同期产检的健康孕妇47例作为对照组。采用Envision免疫组化法测定两组孕妇胎盘组织中IL-10、TNF-α的表达水平，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)测定两组孕妇胎盘组织中SOCS3的表达水平。结果 观察组IL-10的表达明显低于对照组，差异具有统计学意义(Z=-2.578，P<0.05)，TNF-α的表达明显高于对照组，差异有统计学意义(Z=-4.421，P<0.05)；观察组的孕妇胎盘组织中SOCS3表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(Z=-2.325，P<0.05)；两组患者SOCS3的OD值比较差异有统计学意义(t=565.702，P<0.05)。结论 ICP患者的母胎界面TNF-α表达增加，IL-10表达降低，胎盘组织中SOCS3参与了ICP的发病。

妊娠期肝内胆汁淤积症；胎盘；细胞因子信号转导抑制子3；白细胞介素-10；肿瘤坏死因子-α

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠中晚期特发疾病，其导致的死胎死产是围产儿死亡的重要原因之一，而至今其发病机制仍未阐明。从生殖免疫学观点来看，Th1/Th2型细胞因子网络在调节妊娠免疫耐受中发挥重要作用[1]。而研究发现ICP孕妇的Th1/Th2型细胞因子的平衡发生变化，Th1的表达更明显[2]。细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)是近年来新发现的一种负调控蛋白家族中的成员，这类成员主要负责细胞因子信号通路，与Th1/Th2细胞因子失衡、Th2免疫优势有密切关系[3]，缺乏SOCS3可引起胎盘功能不全而导致死胎[4]。目前，关于SOCS3在ICP发病机制中的作用研究较少。本研究通过检测ICP患者和健康孕妇胎盘组织中SOCS3、白细胞介素-10(interleukin 10，IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表达水平，从而了解它们在ICP母胎界面的表达，初步探讨SOCS3在ICP发病中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料

选取新疆医科大学第五附属医院产科2013年10月至2016年10月经剖宫产分娩的ICP患者43例作为观察组，所有孕妇均无肝胆疾病、免疫系统疾病及糖尿病等妊娠合并症。选择47例同期产检的健康孕妇剖宫产分娩者作为对照组。观察所用胎盘组织标本，经过医院的伦理委员会批准，而且患者知情并同意。

1.2方法

1.2.1试剂

所用试剂包括：兔抗人SOCS3蛋白多克隆抗体(购自上海博耀生物科技有限公司)、蛋白质印迹法(WB)、二抗试剂盒(上海研生生化试剂有限公司)、β-微管蛋白(β-tubulin)(上海研生生化试剂有限公司)、预染蛋白Marker(分子量：20～118kD)[爱必信(上海)生物科技有限公司]、RIPA裂解液(RIPA lysis buffer)、蛋白上样缓冲液(上海博耀生物科技有限公司)、免疫组化检测试剂盒(上海研卉生物科技有限公司)、兔抗人IL-10单克隆抗体和兔抗人TNF-α单克隆抗体(上海研生生化试剂有限公司)、SOCS3 ELISA试剂盒(上海恒远生物有限公司)。

1.2.2标本收集及处理

两组研究对象剖宫产术后，立即在无菌条件下进行胎盘组织的选取，胎盘组织主要位于脐带附着处旁开2～3cm，分离出胎盘组织两块，用生理盐水冲洗3遍，其中一块放于10%甲醛中进行固定，时间为24～48h，固定后再依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋备用；另一块放入采用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的环氧树脂(EP)管中，-170℃液氮快速冷冻后转入-80℃冰箱中进行保存。

1.2.3免疫组化法检测胎盘组织中IL-10及TNF-α的表达

采用多聚体(Envision)免疫组化法测定IL-10、TNF-α，严格按照免疫组化试剂盒的说明书进行操作。Envision程序：脱蜡、水化组织切片；预处理组织切片，蒸馏水漂洗，置于三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)中。阻断内源性过氧化物酶(仅用于Envision TM)；蒸馏水漂洗，置于TBS中10min，一抗孵育10～30min，TBS漂洗10min，Envision TM孵育10～30min，TBS漂洗10min，色源底物溶液孵育10min，蒸馏水漂洗，复染及封片后在显微镜下观察细胞，并在450nm处进行光密度(OD)值测定。

1.2.4蛋白免疫印迹法测定胎盘组织中SOCS3的表达水平

按蛋白免疫印迹法(western-blot)标准流程(妊娠组织总蛋白的提取与定量→电泳→电转膜→免疫反应)进行，具体操作按说明书上的步骤进行。结果在450nm处进行OD值测定。

1.2.5 ELISA法测定胎盘组织中SOCS3的表达水平

按照SOCS3 ELISA的说明书进行操作，将标准样和标本样处理后采用酶标仪进行测定。加入显色底物(TMB)100微升/孔，于36℃的孵箱进行避光孵育15min。加入终止液100微升/孔，混匀后并在450 nm处进行OD值测定。

1.3统计学方法

2结果

2.1两组一般资料比较

两组孕妇在年龄、孕周方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

2.2 IL-10及TNF-α在胎盘组织的定位及表达

IL-10、TNF-α主要在胎盘滋养细胞胞质中表达，见图1、图2。IL-10、TNF-α在两组孕妇胎盘组织中均有表达，观察组IL-10的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(Z=-2.578，P<0.01)，而TNF-α的表达水平则明显高于对照组，差异有统计学意义(Z=-4.421，P<0.01)，见表2。

分组例数(n)年龄(岁)孕周(周)观察组4333.2±6.238.3±5.9对照组4731.9±5.840.1±3.3t1.0281.806P0.3070.074

2.3 SOCS3在胎盘组织的表达水平

SOCS3在两组产妇胎盘组织中均有表达，如图3。观察组的孕妇胎盘组织中的SOCS3表达量明显低于对照组，差异有统计学意义(Z=-2.325，P<0.05)，见表2。

注：图1A为滋养细胞胞质内有大量表达，胞质内可见棕褐色颗粒，呈强阳性反应；图1B为滋养细胞胞质内有少量表达，胞质内可见淡黄色染色颗粒，呈弱阳性反应SP×400。

图1 两组IL-10的表达

Fig.1 Expression of IL-10 in two groups

注：图2A为滋养细胞胞质内有少量表达，胞质内可见淡黄色染色颗粒，呈弱阳性反应；图2B为滋养细胞胞质内有大量表达，胞质内可见棕褐色颗粒，呈强阳性反应SP×400。

图2 两组TNF-α的表达

Fig.2 Expression of TNF-α in two groups

表2 两组产妇IL-10及TNF-α在胎盘组织的表达

图3 两组SOCS3的表达

Fig.3 Expression of SOCS3 in two groups

2.4 SOCS3的ELISA结果

观察组的OD值为0.698±0.002，对照组的OD值为0.236±0.005，差异有统计学意义(t=565.702，P<0.05)。

3讨论

3.1 IL-10及TNF-α在胎盘组织的定位及表达

ICP是一种多病因疾病，其临床危害主要在胎儿方面，故母胎界面的异常改变成为研究的着眼点。正常妊娠时胎盘作为免疫隔离部位，使遗传父亲基因的胎儿不受到排斥，因此可以起到免疫耐受的作用。有研究表明正常妊娠时孕妇存在Th2免疫优势，可以避免胎儿的不良结局[4]。国内有研究表明ICP患者的外周血免疫球蛋白降低，从而导致患者血清CD4/CD8比值不断增高，而淋巴细胞转化率不断降低[5]，因此Th1型细胞因子TNF-α、干扰素(IFN)-β升高而Th2型细胞因子IL-4降低[6]，母胎间免疫平衡失调，进而导致该病的发生，同时也会导致母婴的不良结局发生。本研究通过对ICP患者和正常妊娠孕妇的TNF-α、IL-10在胎盘组织中的表达进行分析，结果显示ICP患者的TNF-α表达水平要比正常孕妇高，而IL-10表达要低于正常妊娠孕妇，这个结果说明TNF-α、IL-10在ICP患者母胎界面的表达异常，不利于母婴的结局。

3.2 SOCS3在ICP母胎界面的变化

SOCS是连接蛋白-信号转导子和转录激活子(JAK-STAT)信号通路中的负向调节蛋白，可抑制多种细胞因子的信号通路，并参与T细胞的分化和免疫调控，其表达不足或缺陷，会破坏免疫耐受，导致相应疾病[7]。SOCS3在机体免疫调控中的作用最突出，研究表明SOCS3促进Th1/Th2平衡向Th2偏倚[8]。本研究发现，ICP时母胎界面SOCS3的表达下降，这一结果与董倩等[9]的研究结果部分相符。因此，ICP患者的母胎界面SOCS3表达下降，从而导致胎盘滋养层IL-10的表达不足，使胎盘滋养层受到损害，使母体对胎儿的免疫排斥不断增强，从而出现死胎。

本研究ICP患者胎盘组织中的SOCS3表达降低，从而导致患者的免疫力降低，打破Th1/Th2平衡，从而影响到患者和胎儿的健康，发生不良结局的几率也会增加。因此分析ICP患者的胎盘组织中的TNF-α、IL-10和SOCS3的表达，可以分析ICP患者的发病情况，而且可以通过相应的治疗，减少患者及新生儿的不良结局的发生，进而对准确及详细地分析ICP患者提供一定的参考。

综上所述，ICP患者的母胎界面TNF-α表达增加，而IL-10表达降低，胎盘组织中SOCS3参与了ICP的发病。

[1]王文琦,孙丽洲.SOCS3与妊娠相关疾病的研究进展[J].江苏医药,2014,40(4):447-449.

[2]Namkung J H,Lee J E,Kim E,etal.Association of single nucleotide polymorphisms in the IL-12 (IL-12A and B) and IL-12 receptor (IL-12Rbeta1 and beta2) genes and gene-gene interactions with atopic dermatitis in Koreans[J].J Dermatol Sci,2010,57(3):199-206.

[3]Qiu F,Song L,Yang N,etal.Glucocorticoid downregulates expression of IL-12 family cytokines in systemic lupus erythematosus patients[J].Lupus,2013,22(10):1011-1016.

[4]Gran B,Zhang G X,Yu S,etal.IL-12p35-deficient mice are susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis: evidence for redundancy in the IL-12 system in the induction of central nervous system autoimmune demyelinationn[J].J Immunol,2002,169(12):7104-7110.

[5]Szántó S,Aleksza M,Mihály E,etal.Intracytoplasmic cytokine expression and T cell subset distribution in the peripheral blood of patients with ankylosing spondylitis[J].J Rheumatol,2008,35(12):2372-2375.

[6]莫劲思,董小萍,苏宝兰.妊娠期肝内胆汁淤积症患者的早产预测指标[J].中国妇幼健康研究,2014,25(3): 440-442.

[7]周欣,孙丽洲.细胞因子信号传导抑制因子3与妊娠的研究进展[J].国际妇产科学杂志,2013,40(3):203-206.

[8]温娜,张巧玉,王振国.细胞因子信号转导抑制因子3在早产胎盘中的表达及临床意义[J]．医学综述,2015,21(18):3394-3396.

[9]董倩,李卫平.Th17细胞和调节性T细胞与母胎免疫耐受的关系[J].上海交通大学学报:医学版,2012,32(11):1525-1528.

[专业责任编辑：杨文方]

Changes of IL-10, TNF-α and SOCS3 at maternal-fetal interface of ICP patients

CAO Li-qiong, JIANG Hui-ling, A Mi-na, YI Jin-ling

(DepartmentofObstetrics,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,XinjiangUrumqi830000,China)

Objective To study the changes of interleukin 10 (IL-10), tumor necrosis factor α (TNF-α) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) at maternal-fetal interface of patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP). Methods From October 2013 to October 2016, 43 pregnant women with ICP in the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected in observation group, and 47 healthy pregnant women taking prenatal examination in the same period were selected in control group. The expressions of IL-10 and TNF-α level in placenta of two groups were determined by Envision immunohistochemical method, and the expression level of SOCS3 was determined by ELISA method and Western blot (Western-blot) method. Results The expression of IL-10 of the observation group was significantly lower than the control group with statistical significance (Z=-2.578,P<0.05), but the expression of TNF-α was significantly higher (Z=-4.421,P<0.05). The expression of SOCS3 of the observation group was significantly lower than the control group with statistical significance (Z=-2.325,P<0.05). There was obvious difference in OD value of SOCS3 between two groups (t=565.702,P<0.05). Conclusion The expression of TNF-α increases but IL-10 decreases in maternal-fetal interface of patients with ICP, and SOCS3 in placenta is involved in the pathogenesis of ICP.

intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP); placenta; supressor of cytoking signaling3(SOCS3); interleukin 10 (IL-10); tumor necrosis factor α(TNF-α)

2016-11-16

曹丽琼(1975-)，女，主治医师，硕士研究生，主要从事为妊娠免疫及妊娠合并症的诊治工作。

易金玲，副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.03.013

R714.2

A

1673-5293(2017)03-0259-03