葛伟颖，赵占娟，洪阁，赵建喜

(1.河北大学 医学院，河北 保定 071002； 2.中国医学科学院 生物医学工程研究所，天津 300192；3.河北大学附属医院 放射科，河北 保定 071002)



半乳糖酞菁光动力治疗结肠癌的实验研究

葛伟颖1，赵占娟1，洪阁2，赵建喜3

(1.河北大学 医学院，河北 保定 071002； 2.中国医学科学院 生物医学工程研究所，天津 300192；3.河北大学附属医院 放射科，河北 保定 071002)

为了探讨新型光敏剂半乳糖酞菁(T1—T4)对结肠癌细胞CT-26增殖的影响及其相关机制，通过检测T1—T4的水溶性，利用荧光分光光度计检测T1—T4的浓度和孵育时间对CT-26细胞吸收量的影响.MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测T1—T4对CT-26的细胞毒作用,利用MDC(单丹磺酰尸胺)染色法和流式细胞术检测结肠癌细胞的自噬、凋亡和坏死情况.结果发现T1—T4的水溶性随半乳糖取代基个数的增加而增强，对CT-26细胞的光动力杀伤作用与其浓度呈正相关并且细胞CT-26对T1—T3的吸收量随着孵育浓度的升高和孵育时间的延长而增加，对T4几乎无吸收.T2可诱导CT-26细胞出现自噬、晚期凋亡和坏死，且有较明显的剂量依赖性.通过以上数据了解到 CT-26对T1—T3的吸收随药物浓度和孵育时间的增加而升高,T2介导的光动力疗法对CT-26有明显抑制作用，其机制可能与诱导细胞自噬有关.

酞菁；光动力疗法；自噬；凋亡

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一.近年来,受饮食结构和生活习惯的影响,中国结肠癌的发病率和死亡率呈明显的上升趋势,引起了医药学家的广泛关注[1].目前临床上治疗结肠癌的主要方法依然是传统的手术、化疗、放疗等,但是这些治疗手段均会对正常组织造成一定的损伤,甚至引起严重的并发症,给患者的生活质量造成不良影响,因此寻找新的结肠癌治疗方法仍将是科学家们未来的一项长期而艰巨的任务[2-3].

光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是通过激发光照射肿瘤组织内聚集的光敏剂,使之在分子氧的参与下发生光化学反应,生成单态氧和自由基等ROS(reactive oxygen species)成分,通过氧化作用破坏肿瘤细胞,达到治疗目的.PDT具有创伤小、副作用少、选择性高、无耐药性等特点,自20世纪70年代进入临床研究以来,随着其在技术上的日趋成熟已广泛应用于膀胱癌、胃癌、肺癌、食管癌、宫颈癌等恶性肿瘤的治疗[4-5].光敏剂是光动力治疗中至关重要的因素.酞菁类光敏剂以其明确的化学组成、稳定的理化性质、适宜的长波吸收和高效的光敏活性,成为肿瘤治疗中颇具希望的新一代光敏剂.但是由于酞菁的母体骨架具有较强的疏水性,不利于光敏剂在体内的转运,也给药物制剂带来了许多的困难.本实验室前期通过在单核酞菁外围的苯环上引入半乳糖基团增加酞菁的溶解性和靶向性[6],合成了4个半乳糖酞菁(T1—T4)光敏剂.Lv等[7]的研究表明半乳糖酞菁(T3/T4)不仅具有良好的水溶性,而且表现出一定的肝癌靶向性.李艳周等[8]初步研究了半乳糖酞菁(T1—T4)对人胃癌细胞HGC-27、人恶性黑色素瘤细胞A-375、人非小细胞肺癌细胞A549的光毒性和暗毒性,证明半乳糖酞菁介导的光动力疗法可以有效抑制多种肿瘤细胞的体外增殖,且暗毒性较小,但对其导致肿瘤细胞死亡的机制还不甚清楚.据文献报道，光动力疗法引起细胞死亡的主要途径为凋亡或坏死,以何种途径主要取决于光敏剂的特性、光敏剂定位的细胞器、细胞系类型、细胞密度以及实验方法(包括光敏剂浓度、光剂量、培养时间)等因素[9-10].本文在以往研究的基础上,采用小鼠结肠癌细胞CT-26为模型,评价半乳糖酞菁(T1—T4)的光敏活性、细胞吸收量、吸收速度以及光动力治疗后肿瘤细胞的凋亡情况和自噬规律,探讨4种光敏剂光动力抗肿瘤活性产生的化学物质基础及其作用机制.

1 实验材料

1.1 细胞株

结肠癌细胞CT-26,由中国医学科学院生物医学工程研究所提供.

1.2 主要试剂与仪器

光敏剂T1—T4,由中国医学科学院生物医学工程研究所提供，体外实验时用DMSO均配制成104μmol/L的原液备用；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)由Gibco公司提供；丙酮酸钠溶液、PBS缓冲液为Solarbio公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、100 g/L葡萄糖溶液均为Sigma公司产品；胰蛋白酶(Tripsin)为Hyclone 公司产品；凋亡流式细胞检测试剂盒购自碧云天公司;单丹磺酰尸胺(MDC)由Sigma公司提供.半导体激光器，美国Intense公司;流式细胞仪(Accuri C6)，美国BD公司.

2 实验方法

2.1 对TI—T4光敏剂的脂水分布系数的测定[11-13]

通过分析光敏剂在薄层色谱上的比移值Rf与其在该系统的分配系数logP的关系来测定T1—T4的脂水分布系数.利用反相C18荧光薄层板，以甲醇+水(体积比2∶1)为展开剂展开，测得Rf值，利用下面的公式计算logP值.参考化合物是水杨醛(logP=1.70).

(1)

(2)

Rf为斑点中心距原点的距离与溶剂展开前沿距原点距离的比值，K为常数.

2.2 MTT法测定不同浓度光敏剂在光反应和暗反应时对结肠癌CT-26细胞生长的影响

取处于对数生长期结肠癌CT-26细胞,接种于96孔板中,2×104/孔,培养24 h使其贴壁,24 h后弃去培养基,分为空白对照组和给药组(光反应组和暗反应组),给药组分别加入浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.019 μmol/L的药物培养液100 μL,每个浓度设置4个副孔,结果取平均值;空白对照组给予等体积的空白培养基,置于培养箱孵育24 h后,光照组给予 650 nm 的激光照射,功率0.2 W,照射强度6 J/cm2,照射时间20 min,继续孵育 24 h,每孔加入质量浓度为1 mg/mL的MTT 50 μL培养4 h后弃去上清液,每孔加入150 μL DMSO溶解15 min终止反应,酶标仪上检测各孔在490 nm波长处的OD值,用以下公式计算细胞存活率:

细胞存活率=给药组OD值/对照组OD值×100%.

2.3 标准曲线的绘制

用PBS缓冲液稀释光敏剂,使化合物T1—T4溶液的终浓度依次为0.32、0.63、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L,每个浓度吸取200 μL加入96孔板,设4个副孔,用酶标仪在激发波长640 nm、发射波长690 nm条件下检测各孔的OD值.将光敏剂的OD值与浓度关系制作标准曲线,并做相关回归分析.

2.4 结肠癌细胞对半乳糖酞菁T1—T4吸收量的测定

取对数生长期CT-26细胞用胰酶消化,悬浮于完全培养基中,制成单细胞悬液,接种于96孔板中,2×104/孔,孵育24 h使其完全贴壁后,倾去培养基,给药组分别加入浓度为1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的T1—T4,每个浓度4个副孔,继续孵育24 h,PBS冲洗2次,每孔加入100 μL Triton X-100(体积分数为0.25%)裂解细胞10 min，酶标仪检测每孔OD值,并根据标准曲线计算出每孔的药物含量，以μmol/L表示.

2.5 结肠癌细胞对T1—T4吞噬速度的测定

取对数生长期CT-26细胞制成单细胞悬液,接种于96孔板中,2×104/孔，给药浓度T1—T4均为20 μmol/L.孵育时间分别为2、4、8、12、16、20、24 h,PBS冲洗2遍,加入100 μL Triton X-100(体积分数为0.25%)裂解细胞10 min.上机检测每孔的OD值,并根据标准曲线计算出每孔的药物含量，以μmol/L表示.

2.6MDC染色法检测半乳糖酞菁光动力诱导结肠癌细胞CT-26自噬

取对数生长期CT-26细胞,铺于六孔板中,105/孔，孵育24h使其贴壁,弃去培养基,加入2mL不含血清的化合物T2溶液,浓度依次为0.625、1.25、2.5μmol/L,孵育24h，以650nm的激光照射,功率0.2W,照射强度6J/cm2,照射时间20min.空白对照组避光培养6h后,弃去培养基,加入PBS洗2遍,加入浓度为50μmol/L的MDC溶液,37 ℃孵育60min,加入PBS清洗2遍,倒置荧光显微镜下观察并拍摄,酸性自噬泡呈蓝绿色亮点.

2.7 流式细胞仪检测半乳糖酞菁光动力疗法对结肠癌细胞凋亡的影响

取对数生长期CT-26细胞,铺于六孔板中,5×105/孔，孵育24h使其贴壁,分为空白对照组和光动力治疗组.空白对照组加入不含血清的培养基,光动力治疗组加入不含血清的化合物T2溶液,浓度依次为0.625、1.25、2.5μmol/L,孵育24h后以650nm的激光照射,功率0.2W,照射强度6J/cm2,照射时间20min,空白对照组避光;继续孵育6h,收集细胞,加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPropidiumIodide,室温、避光条件下孵育15min后,上机检测细胞凋亡率.

2.8 统计学分析

采用SPSS16.0 软件进行统计学分析,结果以(均数±标准差)表示,P<0.05为差异有统计学意义.

3 实验结果

3.1 光敏剂T1—T4的脂水分布系数

如图1所示，T1的logP最大，T4的logP最小，logP值越大越易溶于脂，相反越易溶于水.

图1 T1—T4的脂水分布系数Fig.1 Octanol-water partition coefficient of T1—T4

3.2 光敏剂T1—T4对结肠癌细胞CT-26的抑制作用

实验研究了在有光照和无光照的条件下半乳糖酞菁的浓度变化对CT-26细胞存活率的影响.经PDT处理后通过光学显微镜观察到CT-26细胞的形态发生明显改变,细胞的生长明显受到抑制,细胞出现皱缩,折光性下降.严重的可观察到细胞完全坏死、裂解.T1—T4对细胞的抑制作用如图2a所示，在无光照的条件下CT-26细胞的存活率与光照条件下的细胞存活率有很大差异.在无光照条件下,T1—T4在最大浓度时的细胞存活率分别为(47±0.25)%、(67±5.57)%、(91.8±1.16)%、(92.33±4.33)%,可以看出T1、T2对细胞有一定的暗毒性，并且随着浓度的增加暗毒性增大;如图2b所示,在有光照的条件下,其细胞毒性更加明显,在给药浓度为10 μmol/L时细胞存活率T1—T4分别为(7.95±0.24)%、(9.09±0.47)%、(11.85±2.25)%、(89.15±5.15)%,由此看出在同一浓度下,T1的细胞毒性最强,T2、T3、T4依次减弱,T4几乎无细胞毒性.T1、T2、T3的细胞毒性随着浓度的增加而逐渐增大.

a.无光照；b.有光照，照射强度6 J/cm2.图2 T1—T4对结肠癌细胞CT-26的暗毒性和光毒性Fig.2 Phototoxicity and dark toxicity of T1—T4 for colon cancer cells CT-26

图3 T1—T4的药物吸收量标准曲线Fig.3 Standard curve of drug uptake of T1—T4

3.3 半乳糖酞菁T1—T4的标准吸收曲线

首先绘制出化合物的标准吸收曲线(图3)，由图3可看出,光敏剂的荧光强度与浓度呈线性关系且R2值均大于0.99,可用于光敏剂细胞吸收量和吸收速度的测定.

3.4 光敏剂T1—T4的浓度和孵育时间与细胞吸收量的关系

根据标准曲线计算得出光敏剂的孵育浓度-细胞吸收含量关系曲线,如图4a所示.在实验浓度范围内,结肠癌细胞对T1、T2、T3的吸收随着浓度的上升而增加,基本成线性关系,且未出现饱和现象,而对T4的吸收不明显.在同一浓度下,CT-26对光敏剂的吸收量为T1最高,T2、T3次之,T4最低.

根据标准曲线计算出每个时间点细胞的吸收量，绘制出时间-细胞吸收量关系曲线,如图4b所示.在同一浓度下,每个时间点细胞对4个光敏剂的吸收量为T1>T2>T3>T4,说明细胞对T1的吸收速率最快,T2、T3、T4次之;T1、T2、T3的吸收规律均为先快后慢,前期吸收速率较快,随后进入缓慢吸收期,T4基本无吸收.

图4 CT-26对T1—T4的吸收量(a)和吸收速度(b)Fig.4 Absorption of compounds T1—T4 taken up by CT-26 as a factor of(a)concentration and(b)time

3.5 MDC染色法检测半乳糖酞菁光动力诱导结肠癌细胞CT-26自噬

如图5所示,空白对照组的MDC染色荧光强度很弱,而光动力治疗组MDC染色荧光强度及点状结构均较空白对照组明显增多,并且随着光动力治疗给药剂量的增加,荧光强度越明显出现的点状结构越多.

a.空白对照组；b.0.625 μmol/L处理组；c.1.25 μmol/L处理组；d.2.5 μmol/L处理组.图5 MDC荧光染色检测不同浓度T2-PDT后CT-26细胞内自噬泡的分布情况Fig.5 Detection of autophagic vacuoles with different dose of T2-PDT treatment stained MDC

3.6 流式细胞仪检测半乳糖酞菁光动力疗法对结肠癌细胞凋亡的影响

流式结果显示(图6),与空白对照组相比,光动力治疗后的结肠癌细胞死亡以晚期凋亡和坏死为主,早期凋亡的细胞较少，并且晚期凋亡和坏死率随着给药浓度的升高而逐渐增加,呈明显的剂量依赖性.

a.空白对照组；b.0.625 μmol/L处理组；c.1.25 μmol/L处理组；d.2.5 μmol/L处理组.图6 不同治疗浓度T2-PDT对CT-26细胞凋亡的影响Fig.6 Apoptosis of CT-26 cells with different concentration of T2-PDT

4 讨论

光动力疗法(PDT)是利用光敏剂与相应波长的激发光发生光化学反应来实现其抗肿瘤作用的,由于光敏剂和肿瘤组织可特异性结合而激光照射亦可实现局部精准照射,所以光动力疗法对肿瘤组织具有选择性的杀伤作用,而对周围正常组织影响甚小.除此之外,光动力疗法还具有适用范围广、可重复治疗等优点.光敏剂是PDT治疗的关键因素,实验中应用的光敏剂是由中国医学科学院生物医学工程研究所设计合成的酞菁类光敏剂,酞菁属于第2代光敏剂,具有结构单一、光热稳定性好、吸收波长正好在组织最佳透射范围内等优点.半乳糖酞菁是通过向单核无取代酞菁引入半乳糖基团,从而提高了酞菁的两亲性与靶向性.据报道,galectin-3在结肠癌细胞中高表达,galectin-3属于半乳糖凝集素(Gelectin)家族,可诱导内皮细胞分化和血管生长,能够促进肿瘤的发生和转移,被认为是一种潜在的肿瘤预警分子,并且galectin-3可特异性识别半乳糖残基[14].因此,通过半乳糖对酞菁的修饰可提高光敏剂的溶解性、生物相容性及对结肠癌的主动靶向治疗效果.本研究结果显示,结肠癌CT-26细胞对此类光敏剂的吸收呈浓度和时间依赖性.在相同孵育时间下,孵育浓度越高吸收量越大,且并未出现饱和现象;在同一孵育浓度时,T1的吸收量最高,T2、T3、T4依次递减,这可能与这几种光敏剂的分子结构有关.通过检测化合物的水溶性发现T1的logP最大,说明其脂溶性最强,T4的logP最小,说明其水溶性最好.T4的细胞吸收量最少,主要原因可能是细胞膜为亲脂膜,脂溶性强的化合物更易吸收，然而在4种光敏剂中，T4的水溶性最强，脂溶性最弱.另外，T1—T4的分子质量逐渐增大,在进入细胞时其阻力逐渐增大,因此T4不易被细胞吸收.通过吸收速度的结果也可以看出,T1可更迅速地进入细胞内,并且在实验时间范围内,其吸收速率均是先快后慢,T1后期的吸收速率为负值,可能与其产生细胞毒性引起细胞死亡有关.MTT结果显示,在有光照的条件下,T1的细胞杀伤力最强,T2、T3、T4的细胞杀伤力依次减弱,与细胞吸收量结果相对应.在相同时间内,进入细胞的光敏剂越多,其光动力治疗效果越明显.对于光动力疗法引起肿瘤细胞死亡的方式有多种:凋亡、坏死以及细胞自噬.在本文的研究体系中,这3种细胞死亡方式均有体现.实验采用AnnexinV-FITC、PI双染的方法,利用流式细胞仪分析了PDT后CT-26细胞的凋亡和坏死比例,正常细胞不会被FITC、PI着色,早期凋亡的细胞仅被FITC染色,而被双染的细胞则是晚期凋亡和坏死的细胞,结果显示半乳糖酞菁-PDT可同时诱导晚期凋亡和坏死,但是坏死的比例居多,且凋亡和坏死的比例均与给药剂量呈正相关,但是其坏死比例可能更敏感于光敏剂浓度.细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的依赖溶酶体的降解途径,生长因子缺乏、氧自由基、DNA损伤等均可引起细胞自噬[16]；MDC是一种荧光染料,可用来跟踪自噬泡,因此在倒置荧光显微镜下就可以根据荧光信号的强弱变化来判断自噬的活化.本实验结果显示,光敏剂半乳糖酞菁可导致肿瘤细胞的自噬,且自噬水平与浓度呈正相关.有研究报道,如果光敏剂定位于线粒体内,则PDT主要引起细胞发生凋亡;如果定位于溶酶体则主要发生细胞自噬[15].据此可推断此类光敏剂可能定位于肿瘤细胞的溶酶体上,通过促进细胞自噬来诱导细胞死亡.以上研究结果表明,半乳糖取代基提高了酞菁的水溶性和靶向性,其吸收规律与光敏剂浓度、取代基个数、脂溶性等因素有关.根据MDC染色结果和流式结果可大胆推测半乳糖酞菁介导的光动力治疗以引起细胞的自噬、坏死为主,而且本课题组推测其杀伤细胞的机制是破坏细胞的溶酶体和线粒体,但以溶酶体破坏为主,当然这还需要进一步的研究和探讨.

5 结论

半乳糖基增强了酞菁的水溶性,并且随着糖基数目的增加其水溶性增加,亲脂性下降.T1,T2,T3的PDT体外能明显抑制结肠癌细胞的增殖,但T4的效果很弱,这可能与半糖基取代数目和化合物的光化学特性有关.T2-PDT可诱导结肠癌细胞产生大量的自噬泡,通过自噬途径诱导肿瘤细胞死亡,并且通过流式检测到T2-PDT也可引起细胞的坏死.因此，本课题组猜测半乳糖酞菁光动力治疗结肠癌的机制主要是引起细胞的自噬、坏死.

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(责任编辑：赵藏赏)

Experiment research of photodynamic therapy of colon cancer with a novel photosensitizer galactose substituted phthalocyanines

GE Weiying1,ZHAO Zhanjuan1,HONG Ge2,ZHAO Jianxi3

(1.College of Medicine,Hebei University,Baoding 071002,China；2.Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China ；3.Department of Radiology，Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding 071002,China)

To explore the effect and its related mechanism of new photosensitizers galactose substituted phthalocyanines(T1—T4)on the proliferation of colon cancer cell CT-26,consequently to provide experimental basis for the clinical photodynamic therapy of colon cancer,the water distribution coefficient of T1—T4 was detected to understand its water-soluble ability,the concentration and incubation time of T1—T4 were detected by fluorescence spectrophotometer to know their influence on CT-26 cell absorbing capacity,the cytotoxic effect of T1—T4 to CT-26 was detected by MTT the autophagy,apoptosis and necrosis of the colon cancer cells were detected through MDC staining and flow cytometry.It was found that the water-soluble ability of T1—T4 enhanced,with the number of galactose substituents increasing.The photodynamic damage effect of T1—T4 to CT-26 was positively correlated with their concentration.The absorptive amount of CT-26 to T1—T3 increased with the concentration of incubation and with the extension of incubation time,but it can hardly absorb T4.Autophagy,apoptosis and necrosis of CT-26 can be induced by T2,and there is obvious dose-dependent effect.Through the above data, colon cancer cell absorbs more T1—T3 when the incubation concentration and incubation time increase.T2 mediated photodynamic therapy can obviously inhibit CT-26.The mechanism may be due to cell autophagy.

phthalocyanine；photodynamic therapy；autophagy;apoptosis

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.012

2016-09-25

河北大学医学学科建设项目(2015A2001);河北省研究生创新项目(S2016019);中西部高校综合实力提升工程经费资助项目

葛伟颖(1991—),女,河北保定人,河北大学医学部在读硕士研究生.E-mail:837064531@qq.com

赵建喜(1966—),男,河北保定人,河北大学教授,主要从事影像诊断研究.E-mail:jianxizhaov@163.com 洪阁(1980—),男,天津人,中国医学科学院生物医学工程研究所助理研究员,博士,主要从事抗肿瘤药物的研究.E-mail:hongge6688@aliyun.com

X835

A

1000-1565(2017)02-0180-07