赵桂敏，高玉环，刘丽宏，吴晓琳，高哲，刁兰萍

（河北医科大学第四医院血液科，石家庄050000）

rs3660单核苷酸多态性与非霍奇金淋巴瘤相关性研究

赵桂敏，高玉环，刘丽宏，吴晓琳，高哲，刁兰萍

（河北医科大学第四医院血液科，石家庄050000）

目的评估KRT81基因的3’端非翻译区miRNA结合位点rs3660单核苷酸多态性（miR⁃SNP）对非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者癌症风险和临床预后的影响。方法采用连接酶检测rs3660 SNP分型；对数秩检验及Kaplan Meier方法分析rs3660与NHL生存相关性。采用Cox比例风险模型进行多因素生存分析。结果rs3660基因分型在病例组及对照组中分布无统计学差异（P=0.50）。患者携带rs3660 CG/CC基因型与GG基因型比较显示较长的生存时间（P=0.012）。此外，多因素分析证明rs3660与NHL患者总体生存率独立相关（RR=0.589，95%CI：0.415～0.832，P=0.004）。在外周T细胞淋巴瘤亚型中也观察到了这种miR⁃SNP对患者预后的影响价值。结论KRT81rs3660 GG基因型是NHL预后的独立预测标志。

单核苷酸多态性；KRT81基因；rs3660；非霍奇金淋巴瘤；相关

人类非霍奇金淋巴瘤（non⁃Hodgkin’s lympho⁃ma，NHL）已跃居世界第五大癌症，发病率逐年增加［1］。NHL是一种异质性肿瘤，有不同的生物侵袭性和临床过程。弥漫型大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、外周T细胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL）和滤泡淋巴瘤（fol⁃licular lymphoma，FL）是最常见的NHL亚型。虽然NHL是可以治愈的疾病，但有些患者常规化疗后不能达到完全缓解［2］。许多临床因素（年龄、分期、淋巴结或结外侵犯数目、体能状态、B症状和某些生化指标）已确定作为NHL预后的预测因素。这些因素组合成各种临床预后指标，包括针对DLBCL、PTCL患者的国际预后指数（international prognostic index，IPI）和针对FL患者的滤泡IPI（FIPI）［3⁃4］，但是这些预后指标与临床预后并不完全一致。影响NHL患者预后的潜在基因机制还不清楚，许多研究［5］结果促使研究基因变异在NHL预后的预测能力。

MicroRNA（miRNA）是长度约22个核苷酸的新型非编码小RNA，它参与多种生物活动（发育、分化、凋亡、生存、衰老、翻译抑制），并促进信使RNA（mRNA）的降解和代谢［6⁃7］。超过700个miRNA在人类已确定，这些miRNA负责调节至少30%的蛋白编码基因的表达［8］。具体来说，miRNA的目标核苷酸2⁃8在5’端，被称为“种子区”的信使RNA的3’非翻译区。最近研究［9］表明，位于miRNA结合位点的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms of miRNA binding sites，miR⁃SNP）可以调节癌基因、抑癌基因或基因的致癌途径而促进癌变。本研究探讨miRNA结合位点KRT81基因的3’端非翻译区的rs3660单核苷酸多态性与NHL患癌风险及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 组织标本和DNA提取

血液样本收集于2004年至2011年期间河北医科大学第四医院血液科接受化疗和完成随访的188例NHL患者（NHL组），并获得完整临床资料。NHL诊断依据WHO肿瘤分类。同时血液样本也收集120例健康体检者作为对照组。基因组DNA应用向导基因组DNA提取试剂盒（美国Proega公司）立即提取。所有程序都获得河北医科大学第四医院伦理委员会监督和批准。所有参与者均知情同意。

1.2 miR⁃SNP的基因分型

使用连接酶检测反应方法对miRNA结合位点KRT81rs3660进行基因分型。KRT81基因引物（上游，5’⁃GTTAGGCACCCCAACTCAAGT⁃3’；下游，5’⁃GCCAGCGGACTTCTTTCTAGG⁃3’）扩增DNA片段根据NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ snp）。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）应用PCR混合试剂盒说明书进行。连接产品应用ABI 3730XL基因分析仪分离。连接用的探针是S1（5’⁃TTTTTTTTAGCAAGTGCTCAGCTACTTCT CCTC⁃3’），S2（5’⁃TTTTTTTTTTTAGCAAGTGCT CAGCTACTTCTCCTG⁃3’）和S3（5’⁃CACTTTGAAAG ACCCCTCCCACTCCTTTTTT⁃3’）。多态性被证实是基于连接产物的长度差异。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，2个样本率（构成比）比较采用χ2检验。生存曲线使用Kaplan⁃Meier方法计算，生存曲线之间的比较应用对数秩检验。多因素生存分析使用Cox比例风险模型。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NHL患者的临床特征

患者在随访过程中无失访，每3个月评估1次，为期5年，188例NHL患者包括94例DLBCL，65例 PTCL，其他29例，通过单因素和多因素分析进行评估。采用对数秩检验分析5年随访期间收集的数据与患者临床特征之间的关系。临床特征中Ann Ar⁃bor分期、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平、骨髓有无浸润和B症状显示与患者5年生存率潜在相关。调整Cox风险模型使用多因素分析后发现，Ann Arbor分期、LDH水平和B症状认为是NHL生存的独立预测因子，见表1。

2.2 rs3660基因型与NHL癌症风险和预后相关性

结果显示，对照组中GG基因型75例，CG+CC基因型45例，NHL组患者中GG基因型111例，CG+ CC基因型77例，2组差异无统计学意义（P= 0.50）。认为rs3660 SNP在NHL患癌症风险方面没有统计学意义的关联（P>0.05）。对数秩检验评估rs3660 SNP与NHL总体生存相关性发现，患者rs3660 GG基因型和CG/CC基因型5年生存率分别为20.3%、37.2%（P=0.012）。Cox比例风险模型多因素分析发现，rs3660SNP可确定为NHL总生存的独立预测因子（RR=0.589，95%CI：0.415～0.832，P= 0.004），见表1，图1。

图1 rs3660基因型与NHL生存相关性Fig.1 The genotype of rs3660 associated with NHL survival

2.3 rs3660与NHL亚型预后的相关性

结果显示对于PTCL，GG型患者的5年生存率为11.3%，而CG/CC型患者为30.9%。2者差异有统计学意义（P=0.030），调整Ann Arbor分期、骨髓浸润、血清LDH水平和B症状后利用多因素分析发现，rs3660可确定为PTCL预后独立预测因素（RR= 0.345；95%CI：0.163～0.742；P=0.007），见表2、图2。对于DLBCL，这个miR⁃SNP对生存的预测能力无统计学意义，见表3。

表1 单因素和多因素分析临床特点、miR⁃SNP与NHL生存的关系Tab.1 Univariate and multivariate analysis of clinical factors and miR⁃SNP associated with NHL survival

图2 rs3660基因型与PTCL生存相关性Fig.2 The association of rs3660 genotype with PTCL survival

3 讨论

本研究发现rs3660 SNP与NHL患癌风险无关；KRT81rs3660 GG基因型患者的生存时间比CG或CC基因型更短；多因素分析表明，KRT81rs3660 GG基因型是NHL生存的一个独立预后变量。PTCL亚组分析结果与此一致。

在miRNA结合位点的单核苷酸多态性，与miRNA自身多态性一样，是疾病表型的关键因素［10］。少量被识别的miRNA结合位点的单核苷酸多态性对癌症风险和生存相关［11］。miRNA在细胞核中被转录和加工，然后输出到细胞质进一步加工，最终大多数情况下通过RNA诱导沉默复合体结合到目的mRNA的3’非翻译区。miRNA和目标mRNA的互补序列由于RNA沉默诱导蛋白水平减少［12］。研究miR⁃SNP打开了新的癌症生物学和临床肿瘤学研究领域，尤其在危险分层、对治疗的反应等方面［13］。KRT81编码一种Ⅱ型角蛋白Hb⁃1。角蛋白在所有类型上皮细胞表达，在维护细胞完整性、蛋白质合成和细胞内信号转导发挥重要作用［14⁃15］。角蛋白由于不同的表达方式可以作为肿瘤标志物和预后指标［16］。DE LARREA等［17］指出KRT81rs3660在多发性骨髓瘤与肿瘤复发时间和总生存有关。在蛋白质水平已经证明KRT81⁃mir⁃17结合改变杂交过程可能影响RNA⁃miRNA结合结构格式化过程。根据他们的研究，这种rs3660多态性可能影响KRT81功能，从而在肿瘤的发生中起作用。本研究证明KRT81rs3660与NHL生存有关。推测该位点的变相结合能力可以推断KRT81功能和NHL的过程。

表2 单因素和多因素分析临床特点、miR⁃SNP与PTCL生存的关系Tab.2 Univariate and multivariate analysis of clinical factors and miR⁃SNP associated with PTCL survival

综上所述，miRNA结合位点基因型变异可影响癌症患者的预后，rs3660 SNP可确定为NHL预后的独立标志。在miRNA结合位点的基因多态性分析可以帮助识别高危人群。本研究仅初步探讨了miRNA结合位点的单核苷酸多态性，此结论需要进一步研究来验证。

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表3 单因素和多因素分析临床特点、miR⁃SNP与DLBCL生存的关系Tab.3 Univariate and multivariate analysis of clinical factors and miR⁃SNP associated with DLBCL survival

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（编辑 武玉欣）

Association of rs3660 Single Nucleotide Polymorphisms with Non⁃Hodgkin’s Lymphoma

ZHAO Guimin，GAO Yuhuan，LIU Lihong，WU Xiaolin，GAO Zhe，DIAO Lanping
（Department of Hematology，The Fourth Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of single⁃nucleotide polymorphisms at the miRNA binding site rs3660 in the 3’⁃untranslated region of theKRT81gene（miR⁃SNPs）on the cancer risk and clinical prognosis of non⁃Hodgkin’s lymphomas（NHL）.MethodsThe single⁃nucleo⁃tide polymorphisms of rs3660 was genotyped with ligation detection reaction method.The association of rs3660 with NHL survival was calculated with log⁃rank test using Kaplan⁃Meier method.Multivariate survival analysis was performed using a Cox proportional hazards model.ResultsThe rs3660 genotype distribution difference was not statistically significant between the case and control group（P=0.50）.Patients carrying the rs3660 CG/CC genotype exhibited a significantly longer survival time than patients carrying the GG genotype（P=0.012）.In addition，rs3660 was associated independently with the survival of NHL patients in multivariate analysis（RR=0.589，95%CI：0.415⁃0.832，P=0.004）.The associ⁃ation of this miR⁃SNP with NHL survival was further confirmed in the peripheral T cell lymphoma（PTCL）subtype.ConclusionOur results in⁃dicate thatKRT81rs3660 GG type is an independent prognostic marker in NHL.

miR⁃SNP；KRT81；rs3660；non⁃Hodgkin’s lymphoma；correlation

R733.4

A

0258-4646（2017）04-0321-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.04.009

河北省科技支撑计划项目（135200）

赵桂敏（1978-），男，主治医师，硕士.

刁兰萍，E-mail：diaolanping@163.com

2016-09-16

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