陶 陶，沈 洲，项 平，黄 涛，陈恕求，宣 强，肖 峻

HK2基因在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞恶性表型的影响

陶 陶1，沈 洲1，项 平1，黄 涛1，陈恕求2，宣 强1，肖 峻1

目的 探讨HK2基因在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞恶性表型的影响。方法 利用基因芯片数据库和免疫组化法检测HK2基因在前列腺癌组织中的表达。应用RNA干扰技术敲低HK2表达后，采用细胞糖代谢试剂盒、CCK-8和流式细胞术检测前列腺癌细胞的有氧糖酵解、增殖和凋亡能力的改变。结果 HK2基因的表达水平随着前列腺癌的进展显著上升；抑制HK2基因表达后，前列腺癌细胞的有氧糖酵解和增殖能力显著降低，细胞的早期凋亡明显增加。结论 HK2基因在前列腺癌的恶性进展中表达上调，促进细胞的增殖和糖代谢，抑制细胞早期凋亡；其潜在分子机制有待进一步研究。

前列腺肿瘤；己糖激酶2；糖代谢；增殖；凋亡

近年来，肿瘤能量代谢方式的改变受到研究人员越来越多的关注。2000年Hanahan与Weinberg在《Cell》上发表了题为“Hallmarks of Cancer: the Next Generation”的综述，将肿瘤的六大特征扩展至十项[1]。其中能量代谢方式的改变，被列为新提出的肿瘤四大特征之一。正常细胞在有氧条件下将葡萄糖经三羧酸循环彻底氧化生成水和二氧化碳；在缺氧条件下则进行无氧糖酵解生成乳酸。与之不同的是，肿瘤细胞在上述两种条件下均表现为活跃的葡萄糖摄取和糖酵解，这种现象被称为Warburg效应。葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸等糖酵解中间产物是生物大分子合成的主要来源，因此肿瘤细胞糖酵解的意义在于提供生物大分子合成所需的原料，促进肿瘤细胞的生长，同时帮助肿瘤细胞耐受外部不稳定的营养物质供应，促进肿瘤细胞存活[2]。本文实验关注细胞糖酵解过程中的第一个限速酶己糖激酶2型(Hexokinase Ⅱ, HK2)基因在前列腺癌中的表达及其在前列腺癌细胞恶性进展中的作用。

1 材料与方法

1.1 前列腺癌组织标本及前列腺癌细胞系培养 前列腺增生、激素依赖性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌基因芯片表达谱数据下载于GEO35988数据库[3]；前列腺癌及正常前列腺组织标本取自东南大学附属中大医院病理组织库；其中25例前列腺癌组织(病理证实为前列腺腺泡细胞癌，Gleason评分>7分)和15例癌旁正常前列腺组织用于免疫组化检测；PC-3细胞系用含有10%胎牛血清(Gibco公司)，2 mmol/L谷氨酰胺(Glu)，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(GIBCO公司)培养，细胞常规置于37 ℃ 5%CO2培养箱，每2～3天更换1次培养液。PC-3细胞购于上海中科院细胞库。

1.2 shRNA干扰序列 HK2-shRNA由上海吉玛公司设计并构建。HK2 shRNA序列：5′-GACCCTCTACAAGCTACAT-3′，阴性对照(NC)shRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。Lipofectamine 2000转染试剂和HK2 shRNA混合到Opti-MEMI中，得到转染混合液。孵育15 min后更换6孔板中的培养基为转染混合液，更换前用PBS润洗2～3遍。之后放入培养箱中继续培养，培养8 h后更换为完全培养基。

1.3 免疫组化 石蜡切片脱蜡脱水，置于3%H2O2溶液中室温孵育30 min，置于抗原修复液中微波修复，血清封片，滴加稀释好的HK2一抗(1 ∶500稀释，美国Abcam公司)，置于湿盒内，4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次，滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃孵育，PBS洗5 min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，DAB显色，阳性表达于细胞质。光镜下检测并评价显色结果。按阳性细胞百分比评分：阳性细胞数<5%为0分，6%～30%为1分，31%～70%为2分，>70%为3分。按显色程度评分：无阳性染色为0分，棕色较弱为1分，中度棕色为2分，棕色较深为3分。将两项得分结果相加：0～1分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为()，6分为()。

1.4 荧光定量PCR实验 转染HK2-shRNA 48 h后Trizol法提取细胞总RNA，分光光度计检测浓度，按试剂盒的操作说明行MMLV酶逆转录和荧光定量PCR检测，以β-actin作为内参，2-ΔΔCT法计算相对表达量。HK2引物序列：F 5′-ATCCCTGAGGACATCATGCGA-3′，R 5′-CTTATCCATGAAGTTAGCCAGGCA-3′；β-actin引物序列：F 5′-AAGACCTGTACGCCAACACAGT-3′，R 5′-AGAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。

1.5 CCK-8实验 转染HK2-shRNA 12 h后用于胰酶消化，通过血球计数板计数后，以每孔2 000个细胞接种于96孔培养板，37 ℃ 5%CO2培养。分别于24 h、48 h、72 h和96 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育2 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，每组设3个复孔。

1.6 糖酵解检测实验 转染HK2-shRNA 12 h后用胰酶消化，将PC-3细胞均匀接种于24孔板中(每孔100 000个细胞)，每孔加培养基200 μL，放入细胞培养箱以37 ℃ 5%CO2培养72 h后，收集细胞上清液培养基，按照BiVision乳酸分析试剂盒说明，测量OD值。用胰酶消化细胞后计数，按照标准曲线计算出各组等量细胞所产生的乳酸量。

1.7 细胞凋亡实验 转染48 h后收集细胞，PBS洗涤2次，用400 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度约为1×106个每毫升，在细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀后于4 ℃避光条件下孵育15 min，加入10 μL PI后轻轻混匀于4 ℃避光条件下孵育5 min，1 h内上机检测。

1.8 统计学方法 数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，每组实验重复3次。病理组织中HK2的阳性率比较采用χ2检验，细胞实验中组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌组织中HK2基因的表达 通过对GE035988芯片数据库的分析发现，与前列腺增生组织(n=28)相比，HK2基因在前列腺癌组织中的表达显著上升；且在去势抵抗性前列腺癌组织中(n=35)的HK2基因表达显著高于激素依赖性前列腺癌组织(n=59)(图1)。免疫组化结果显示，HK2蛋白在前列腺癌组织中的表达(60%，15/25)明显高于正常前列腺组织(20%，3/15)(图2)。

图1 HK2基因在前列腺癌GEO35988数据库中的表达

BPH.前列腺增生组织；ADPC.激素依赖性前列腺癌；CRPC.去势抵抗性前列腺癌；***P<0.01

图2 HK2蛋白在正常前列腺组织(A)和前列腺癌组织(B)(腺泡细胞癌，Gleason>7分)中的表达，SP法

2.2 转染HK2-shRNA后HK2的表达水平变化 HK2-shRNA(sh-HK2)转入前列腺癌细胞PC-3后，通过荧光定量PCR和Western blot实验验证，相对于NC组，实验组的HK2在mRNA和蛋白表达水平显著降低(图3)。

2.3 sh-HK2抑制前列腺癌细胞的有氧糖酵解能力 在前列腺癌细胞PC-3中转染sh-HK2，利用Bivision乳酸探针试剂盒检测转染后72 h细胞培养基中的乳酸含量。与NC组相比，sh-HK2组的乳酸产生量显著减少，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

图3 转染sh-HK2质粒敲低HK2的表达

A.运用荧光定量PCR检测sh-HK2处理后细胞中HK2 mRNA的表达，**P<0.01；B. Western blot法检测sh-HK2处理后细胞中HK2蛋白的表达

图4 BiVision乳酸探针试剂盒检测转染sh-HK2后72 h细胞培养基中的乳酸含量 **P<0.01

2.4 HK2-shRNA抑制前列腺癌细胞的增殖能力 在前列腺癌细胞PC-3细胞中转染sh-HK2，利用CCK-8法检测细胞增殖能力变化。sh-HK2转染组PC-3细胞从种板后48 h开始吸光度数值下降(P<0.05)，并随着时间的推移差异趋势逐渐扩大(P<0.05，图5)。由此说明，敲低HK2表达后，前列腺癌细胞PC-3的增殖能力受到显著抑制。

2.5 转染sh-HK2后前列腺癌细胞凋亡增加 在转染sh-HK2 48 h后，AnnexinV FITC/PI双标法检测细胞凋亡。sh-HK2组细胞凋亡显著增加，达(6.71±0.66)%，明显高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05，图6)。表明转染sh-HK2后前列腺癌细胞凋亡增加。

3 讨论

图5 CCK-8法检测sh-HK2处理细胞后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情况 *P<0.05，**P<0.01

图6 转染sh-HK2 48 h后AnnexinV FITC/PI双标法检测细胞早期凋亡水平的改变

目前，根治性前列腺癌切除术和放疗是治愈局限性前列腺癌的主要治疗手段。而对于转移性前列腺癌、局部进展前列腺癌无法行根治性切除或放疗的患者，通常采用雄激素剥夺治疗来延缓肿瘤的进展，但经过14～30个月的中位时间后，几乎所有患者的病变均将逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌[4]。且CRPC变得难以控制并且更容易出现转移，已成为晚期前列腺癌患者死亡的主要原因，中位生存时间小于20个月，目前仍缺乏更为有效的治疗方法，多烯紫杉醇作为最有效的化疗药物，也仅能延长患者的总生存期2～2.5个月[5]。最新研发的靶向前列腺癌雄激素受体(AR)的药物恩杂鲁胺虽然可以在一段时间内抑制肿瘤的生长，但随着肿瘤细胞AR的扩增、突变、剪切体形成及潜在的分子信号旁路的激活而疗效逐渐减弱。新近研究发现，恩杂鲁胺在抑制肿瘤生长的同时，却激活了肿瘤转移相关信号通路。由此可见，目前人们对于前列腺癌的恶性表型、进展机制、分子靶标及有效的治疗手段依旧知之甚少[6]。深入研究去势抵抗性前列腺癌的形成及进展机制，找到有效的治疗去势抵抗性前列腺癌的关键分子靶标仍是今后一个阶段研究的重点和难点[7]。

物质和能量代谢是生命活动的基本特征之一。人体日常生命活动所需要的能量主要来自葡萄糖的分解代谢所提供。在常氧环境下，葡萄糖通过糖酵解途径和三羧酸循环(TCA)彻底氧化分解成H2O和CO2；在缺氧条件下，葡萄糖经糖酵解生成乳酸，乳酸又可通过乳酸循环转变成肝糖原或血糖。这两种代谢途径均可为细胞提供相应的能量，但葡萄糖经过TCA生成ATP的数量远远高于糖酵解。与正常细胞不同，肿瘤细胞需要更多的能量和大分子原料以维持其无限快速增殖的特性。糖酵解代谢不但为肿瘤细胞的生长提供能量，而且为肿瘤细胞在快速增殖过程中合成重要的生物大分子提供原材料。这一现象被称为Warburg效应[2,8]。糖酵解过程主要包括两个阶段，即葡萄糖分解为丙酮酸和丙酮酸还原为乳酸。细胞液是所有糖酵解酶促反应进行的部位。糖酵解过程包含己糖激酶(HK)、6-磷酸果糖激酶-1(PF1)和丙酮酸激酶(PK)三个关键酶，其余的催化酶虽不是关键酶，但也起着至关重要的作用。HK是调节细胞糖酵解的第一个关键酶。Warburg[9-10]研究细胞糖代谢时发现肿瘤细胞HK催化活性增高。随后研究发现，在多种恶性肿瘤细胞中，HK1和HK2均呈现出高表达，并且以HK2与肿瘤相关性最密切[11-12]。HK2在肿瘤细胞中常高表达并能够与线粒体外膜结合。由此，HK2能够直接优先利用线粒体合成的ATP，完成糖酵解第一步，使得进入糖酵解葡萄糖量增加。研究表明，HK2在肿瘤细胞中具有促进增殖和抗凋亡的双重特性，在肿瘤的恶化进程中促进肿瘤细胞增殖和存活起到重要作用。GPI在糖酵解反应中能够催化6-磷酸葡萄糖转变为6-磷酸果糖。目前人们发现，GPI不仅可以促进肿瘤的增殖，也能够活化基质金属蛋白酶从而增强肿瘤的迁移能力。LDHA在调节糖酵解最后一步中起着关键作用，能够催化丙酮酸还原成乳酸，并消耗NADPH。研究发现，LDHA主要表达于肿瘤之中，并作为淋巴瘤、前列腺癌、肾癌和黑色素瘤等多种恶性肿瘤的生物标志物[13-16]。在本组实验中，作者首选利用GEO35988数据库分析HK2基因在前列腺癌发生和进展过程中的表达趋势，结果表明HK2在前列腺癌中的表达水平显著高于前列腺增生组织，且在去势抵抗性前列腺癌中的表达水平显著高于激素依赖性前列腺癌。进一步，本实验用免疫组化法验证了HK2在前列腺癌组织中表达明显高于正常前列腺组织。体外实验证明，抑制HK2的表达后，前列腺癌细胞的增殖和有氧糖酵解能力受到明显抑制；细胞的早期凋亡率显著上升。由此提示，HK2基因在前列腺癌的发生及恶性进展中起着重要的作用，可作为前列腺癌分子诊断和治疗的潜在靶点之一。

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Expression of HK2 in prostate cancer and its effect on malignant phenotype of prostate cancer cells

TAO Tao1, SHEN Zhou1, XIANG Ping1, HUANG Tao1, CHEN Shu-qiu2, XUAN Qiang1, XIAO Jun1

(1DepartmentofUrology,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China;2DepartmentofUrology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

Purpose To study the expression of HK2 in human prostate cancer (PCa) tissues and its effect on malignant phenotype of prostate cancer cells. Methods HK2 expression in PCa tissues was determined by microarray database and immunohistochemical staining. Subsequently, the change of cellular phenotype was detected by glycometabolism kit, CCK-8 kit, and flow cytometry after HK2 knockdown. Results HK2 expression was elevated followed by prostate cancer development. HK2 depletion inhibited cellular proliferation and aerobic glycolysis, and increased the ratio of early apoptosis. Conclusion HK2 expression increases in the process of PCa malignant progression. It plays a critical role in cellular proliferation, glycometabolism, and apoptosis, the mechanism of which needs further exploration.

prostate neoplasms; HK2; glucose metabolism; proliferation; apoptosis

时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.016.html

安徽省自然科学基金(1708085QH202、1608085MH166)

1安徽医科大学附属安徽省立医院泌尿外科，合肥 2300012东南大学附属中大医院泌尿外科，南京 210009

陶 陶，男，博士，医师。E-mail: taotao860721@126.com 肖 峻，男，博士，副教授，通讯作者。E-mail: xjdoctor@126.com

R 737.25

A

1001-7399(2017)02-0149-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.007

接受日期：2016-12-20