庞雪莲，王玻玮，李巧新，马志萍，师 艺，张 巍，崔文丽

新疆汉族及维吾尔族结直肠癌原发灶与转移灶中KRAS基因突变分析

庞雪莲，王玻玮，李巧新，马志萍，师 艺，张 巍，崔文丽

目的 观察新疆地区汉族、维吾尔族人群中结直肠癌(colorectal cancer, CRC)原发灶与转移灶中KRAS基因状态的差异及其与CRC患者临床病理特征之间的关系。方法 收集2012年～2014年间新疆地区汉族及维吾尔族CRC标本189例，其中52例有配对转移灶。采用突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system, ARMS)进行KRAS基因12、13密码子已知常见突变位点检测。结果 KRAS基因在CRC原发灶病例中汉族、维吾尔族的突变率分别为42.8%(62/145)、43.2%(19/44)，两者差异无显著性(P>0.05)，T3/T4期及有淋巴结转移的病例中突变率较高(P<0.05)，但与患者性别、民族、年龄、分化程度、TNM分期、有无远处转移、原发灶所在的部位均无相关性(P>0.05)。KRAS基因在CRC转移灶中汉族、维吾尔族的突变率分别为33.3% (12/36)、31.3% (5/16)，两者差异无显著性(P>0.05)，并发现年龄≥65岁者突变率较高(P<0.05)，与所研究的其他临床病理特征无相关性。52例转移灶中KRAS基因的突变率为32.7%(17/52)，而对应的原发灶突变率达50%(26/52)，明显高于转移灶(P<0.000 1)，转移灶突变类型与原发灶一致。结论 KRAS基因在浸润较深、有淋巴结转移及65岁以上发生转移的CRC中突变率较高，在原发灶的突变率高于配对转移灶。KRAS基因突变率在新疆汉族、维吾尔族CRC患者中差异无显著性，提示KRAS基因突变促进CRC的进展，并且在原发灶中更易发生突变，但汉族、维吾尔族间无差异。

结直肠肿瘤；KRAS基因；汉族；维吾尔族；原发灶；转移灶

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球常见的恶性肿瘤之一[1]。根据WHO报道：在常见恶性肿瘤中男性CRC发病率位居第3位，女性位居第2位。流行病学研究发现，CRC的发病与地理位置具有相关性[2]。中国CRC的发病率和病死率呈上升趋势，每年新发病例数达30万例，居全球首位[3]。CRC的发生、发展是多因素、多基因共同参与的结果[4]，表皮生长因子受体(EGFR)信号通路与CRC的发生、发展密切相关，KRAS位于EGFR下游，KRAS基因是否发生突变对CRC患者能否接受EGFR抗体治疗有重要临床参考价值[5]。大样本、多中心Ⅲ期临床研究结果显示KRAS基因2号外显子第12、13密码子基因状态与EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗、帕尼单抗的疗效呈负相关，当其为野生型时患者才可从EGFR抗体治疗中获益[6]，因此准确检测结直肠患者KRAS基因状态对患者能否接受靶向治疗意义重大。

亚洲人群KRAS基因的突变率低于白种人和黑种人，但是不同民族的CRC患者KRAS基因突变率是否一致尚未见报道[7]。新疆地处内陆亚洲中心，维吾尔族是新疆地区的特有民族，维吾尔族与本地区汉族CRC患者KRAS基因状态是否有差异，KRAS基因状态与患者临床病理特征之间是否有关，以及原发灶及转移灶之间是否存在异质性？本实验将针对以上问题进行分析探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验通过新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会的批准，且术前均获得患者知情同意书。选择新疆医科大学第一附属医院2012年1月～2014年12月间189例术前未经任何治疗的CRC手术标本，包括145例汉族及44例维吾尔族，其中52例有配对转移灶，由两名资深病理医师确诊，按WHO诊断标准对肿瘤进行病理分型，病例组织均为腺癌，52例配对转移灶标本包括45例淋巴结转移灶，7例肝/肺转移灶。被检样本均经过严格质控，纳入标准必须符合：(1)组织中肿瘤细胞所占比例≥30%；(2)所有肿瘤细胞的总数不能低于200个。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 使用Qiagen DNA Min Kit(51304)，按照试剂说明书完成石蜡组织DNA提取，所提取DNA纯度均达到：OD260/280=(1.8±0.2)，OD260/230≥1.7，浓度20～50 ng/μL，DNA提取试剂盒购于德国Qiagen公司。

1.2.2 KRAS基因突变检测 按照KRAS突变检测试剂盒说明书，每个样本含8个孔位，分别用于检测12密码子的G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A位点，13密码子的G13D位点，以及内参基因。采用Agilent Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪进行检测，人KRAS基因突变检测试剂盒购于北京雅康博公司。

1.2.3 实验质量控制 每批检测均含阴性及阳性质控品，每个孔位均有FAM和HEX两个通道，阴性质控两通道均为阴性，阳性质控两通道均为阳性；被检测样本HEX通道(为内控基因)阳性，满足以上条件才可判读KRAS基因位点是否突变，样本FAM通道Ct值<28判读为突变型(图1)。

图1 A.样本除阴性对照余内控HEX通道位点均为阳性；B.FAM通道除了阳性对照位点阳性，余位点均阴性，判读为KRAS基因野生型；C.FAM通道除了阳性对照位点阳性，有1个位点阳性，判读为KRAS基因某位点单突变型；D.FAM通道除了阳性对照位点阳性，有2个位点阳性，判读为KRAS基因某位点双重突变

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，阳性率比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KRAS基因在汉族及维吾尔族CRC原发灶及转移灶中的基因状态 189例CRC原发灶病例中KRAS基因的总突变率为42.9%(81/189)，汉族和维吾尔族分别为42.8%(62/145)、43.2%(19/44)，两者差异无显著性(P>0.05)。其中69例为12密码子突变(85.2%，69/81)，仅12例为13密码子突变(14.8%，12/81)。以单突变为主，4例发生双重突变(4.9%，4/81)，突变率最高的位点是G12D，占总突变的38.3%(31/81)(表1)。52例配对转移灶中有45例为淋巴结转移灶，7例为肝/肺转移灶，共17例发生KRAS基因突变，突变率为32.7%(17/52)，汉族、维吾尔族突变率分别为33.3%(12/36)、31.3%(5/16)，两者差异无显著性(P>0.05)，均为12密码子突变，突变率最高的位点也是G12D(47.1%，8/17)。在淋巴结转移灶中的突变率为17.8%(8/45)，肝/肺转移灶的突变率为57.1%(4/7)，肝/肺转移灶的突变率明显高于淋巴结转移灶(P<0.05，表2)。

2.2 KRAS基因突变与CRC临床病理特征的关系 在原发灶病例中，KRAS基因突变在肿瘤浸润程度较深(T3+T4)(48.1%，63/131)及有淋巴结转移(N1+N2)者中的突变率较高(54.4%，37/68)(P<0.05)，但与患者性别、民族、年龄、肿瘤分化程度、组织学分型以及有无远处转移无关(P>0.05，表1)。在转移灶病例中发现KRAS基因在≥65岁时突变率较高(50.0%，10/20)(P<0.05)，此外与所研究的其他临床病理特征无相关性(P>0.05，表2)。

原发灶病例中12密码子突变69例，13密码子突变12例，发现12密码子高、中分化时突变率高，(71.0%，49/69)，而13密码子则在低分化时突变率较高(66.7%，8/12)。Ⅲ+Ⅳ期时12密码子突变率较高(53.6%，37/69)，但是13密码子在Ⅰ+Ⅱ期时突变率较高(83.3%，10/12)。有淋巴结转移时12密码子突变率较高(50.7%，35/69)，但是无淋巴结转移时13密码子突变率较高，占13密码子突变的83.3%(10/12)(表1)。

2.3 KRAS基因状态在CRC原发灶及转移灶中的比较 在52例配对的原发灶及转移灶CRC中，KRAS基因状态并不一致，原发灶突变型26例、野生型26例，在与之配对的淋巴结转移灶中突变型17例、野生型35例，有9例原发灶为突变型转移灶为野生型，并未出现原发灶野生型转移灶突变型的情况，经统计原发灶的突变率明显高于转移灶(P<0.001)，发生突变的转移灶与原发灶突变类型一致(表3)。

应用配对χ2检验CRC原发灶与转移灶之间KRAS基因状态是否有差异，原发灶突变型26例，野生型26例，在与之配对的转移灶中突变型17例，野生型35例，有9例原发灶为突变型，转移灶为野生型，差异有统计学意义。

3 讨论

近年来很多学者对KRAS基因与CRC的相关性进行了研究，发现KRAS基因在CRC中的突变率达35%～40%，突变主要发生在12、13密码子，其中以12密码子为主[8]。本组实验结果显示KRAS基因在CRC原发灶中的总突变率为42.3%，与文献报道结果接近，但在转移灶中的突变率仅为32.7%，比文献报道数据偏低，因此讨论原发灶、转移灶KRAS基因异质性很有意义。

表1 CRC原发灶KRAS基因及其12、13密码子基因状态及与之间的关系[n(%)]

Yamauchi等[9]的实验结果发现直肠癌更易发生KRAS基因突变，但本组实验却未发现结肠、直肠KRAS基因状态存在差异。关于结肠KRAS基因突变率，文献报道存在不一致性，如Bleekr等发现右半侧结肠癌突变率较高，Zulhabr等发现左侧突变率较高，本组实验结果发现左侧、右侧及横结肠KRAS基因突变率差异无显著性。针对收集的结肠癌样本量分析，Bleeker等[10]收集了55例，Zulhabri等[11]收集了70例，本实验共有100例结肠癌标本。以上研究样本量均不大，而且来自不同地域，有待于扩大样本，大样本多因素分析，明确KRAS基因突变与结肠癌部位的相关性。

有很多学者研究了KRAS基因的状态与CRC患者临床病理特征的相关性。本组实验结果显示，KRAS基因在有淋巴结转移、浸润程度较深的CRC病例中突变率较高，也有学者得到相似的结果[12]，这恰好反应了肿瘤恶性程度与KRAS基因突变呈正相关。本组实验结果发现在CRC转移灶中KRAS基因在≥65岁者中突变率高，Kadowaki等[13]研究发现65岁以上的CRC患者生存率更低，这与KRAS基因突变导致高龄患者不良预后密切相关。本组实验结果发现KRAS基因状态在汉族与维吾尔族CRC患者之间无差异，马玲等[14]发现维吾尔族肺癌患者KRAS基因突变率高于汉族患者，但是目前并未发现KRAS基因在不同民族或种族CRC患者间有差异[15-16]，这提示KRAS基因状态在同一地区不同民族CRC患者间可能无差异，也有待于大样本进一步验证。

本组实验结果发现KRAS基因在配对的原发灶、转移灶样本中突变率有差异，原发灶的突变率高于转移灶，并且转移灶突变型的病例原发灶必定为突变型，但是原发灶为突变型的样本转移灶可能为野生型。目前关于CRC中KRAS基因原发灶、转移灶之间的异质性研究很多，结果也大相径庭， Kleist等[17-18]研究发现KRAS基因在发生肝/肺转移的原发灶及转移灶中突变率不一致，既有原发灶野生型转移灶突变型也有原发灶突变型转移灶野生型，但是也有学者发现KRAS基因在原发灶及转移灶之间存在一致性，尤其是非淋巴结转移灶一致性较高[19]。本组实验结果发现KRAS基因状态在原发灶与肝/肺转移灶一致，但是原发灶与淋巴结转移灶之间不一致，前者高于后者。肿瘤细胞极易发生突变，在肿瘤形成和发育的不同阶段，具有不同的基因突变和表达谱；肿瘤组织存在异克隆生长现象，因此转移病灶和原发灶之间可能具有不同的生物学特性和特异性基因表达特点；淋巴结转移灶通常样本量较小或肿瘤细胞比例低，可能发生假阴性结果，但是本组实验纳入样本的淋巴结转移灶标本均是通过严格筛查，肿瘤细胞比例不足者予以剔除，所以假阴性可能性小。淋巴细胞因子可以作用于RAS信号通路影响KRAS基因的表达[20]，因此推测淋巴细胞的自身免疫抑制了KRAS基因发生突变。

表2 CRC转移灶KRAS基因状态与临床病理特征之间的关系[n(%)]

表3 KRAS基因突变状态在CRC原发灶与转移灶之间的比较[n(%)]

KRAS基因在原发灶及转移灶之间的异质性对指导临床治疗具有重要意义，尤其是对于只能获取转移灶标本的晚期肿瘤患者具有重要指导意义，选取肝肺转移灶比选取淋巴结转移灶与原发灶的一致性更高。

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时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1015.044.html

国家自然科学基金(81360352)、国家自然科学基金地区基金(81560035)、新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C032)、科技支撑计划(14495800300)、自治区青年科技创新人才培养工程(qn2015bs011)

新疆医科大学第一附属医院病理科，乌鲁木齐 830054

庞雪莲，女，硕士，医师。Tel: (0991)4362806，E-mail: 448665867@qq.com 崔文丽，女，博士，副主任医师，通讯作者。E-mail: cwl860@163.com

R 735.3

A

1001-7399(2017)02-0195-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.019

接受日期：2016-09-21