裘纪莹,赵双枝,赵玉忠,陈蕾蕾,王同燕,王未名,*

(1.山东省农业科学院农产品研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室,山东济南 250100; 2.山东省医学科学院,山东济南 250062)

裘纪莹1,赵双枝1,赵玉忠2,陈蕾蕾1,王同燕1,王未名1,*

(1.山东省农业科学院农产品研究所/山东省农产品精深加工技术重点实验室,山东济南 250100; 2.山东省医学科学院,山东济南 250062)

建立了采用高压半制备液相色谱制备石菖蒲中β-细辛醚和α-细辛醚高纯单体化合物的方法。首先以石菖蒲为原料制备石菖蒲挥发油,然后采用高压半制备液相色谱,设定流动相为甲醇∶水=65∶35(v/v),对β-细辛醚和α-细辛醚进行精制纯化。产物的结构采用EI-MS、1H-NMR 和13C-NMR进行鉴定,而且它们的纯度分别达到99.43%和99.08%。该方法操作简单、制备量大、产物纯度高,可用于石菖蒲中高纯度β-细辛醚和α-细辛醚对照品的制备。

石菖蒲,高压半制备液相色谱法,β-细辛醚,α-细辛醚,纯化

石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根茎,具有豁痰开窍、化湿和胃、醒神益智、芳香宁神的功效[1]。近代药理学研究表明石菖蒲的有效成分——挥发油对中枢神经、心血管、呼吸和消化等多种系统具有调节作用[2],其主要有效成分为β-细辛醚和α-细辛醚(图1)[3]。同时研究表明,β-细辛醚和α-细辛醚在抗肿瘤、治疗中枢神经系统疾病及抗炎方面均具有良好的药效[4-7]。可见,制备β-细辛醚和α-细辛醚高纯单体化合物对于石菖蒲药材的质量控制、成药的生产工艺优化和质量控制以及β-细辛醚和α-细辛醚的药理学研究等都非常重要。

高压半制备/制备液相色谱技术是目前发展迅速的一种快速分离纯化技术,该技术在分析型高效液相色谱技术的基础上发展而来,具有上样量大、分离度和灵敏度高、分离速度快和目标化合物纯度高等特点,是目前半制备/制备高纯度单体化合物的优选手段[8]。如王智聪等[9]采用高压制备液相色谱法制备没食子儿茶素没食子酸酯高纯单体化合物,结果显示该方法操作简单、制备量大、收率高、产物纯度高,可用于没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)标准物质的研制。丁雯静等[10]采用快速制备液相色谱从库拉索芦荟中高效分离制备了10-羟基芦荟大黄素苷A和B,结果显示该方法简便、快速,所得产物纯度较高,可用于对照品的制备和药理毒理活性研究。本文以石菖蒲为原料制备其挥发油,并采用高压半制备液相色谱法对其进行精制纯化和结构鉴定,最后得到高纯度的β-细辛醚和α-细辛醚,以期为采用高压制备液相色谱法制备石菖蒲中的β-细辛醚和α-细辛醚标准物质提供参考。

图1 α-细辛醚和β-细辛醚的化学结构式Fig. 1 The structures of α-asarone and β-asarone

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石菖蒲药材 济南建联中药店;甲醇 色谱级,山东禹王试剂有限公司;乙醇、石油醚等 均为分析纯,天津市广成化学试剂厂。

安捷伦1200分析型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司;岛津LC-6A高压半制备液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石菖蒲挥发油的制备 制备方法参照文献[2],具体为:称取一定量的石菖蒲药材,采用50%乙醇回流提取3次,合并提取液,提取液浓缩至无醇味,过滤,将沉淀部分减压干燥后用石油醚回流提取3次,合并石油醚提取液,回收溶剂至干,既得石菖蒲挥发油提取物。

1.2.2 高压半制备液相色谱分离 将上述提取物用100%甲醇溶解,通过0.45 μm微孔滤膜过滤后进样量200 μL,根据色谱图接收馏分,对所得馏分采用HPLC面积归一法[11]进行纯度检测,采用EI-MS、1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定。

1.2.3 液相色谱条件 分析采用1200型高效液相色谱仪,配置G1311A型四元梯度泵,G1329A型自动控温进样器,G1314B型可变波长检测器,G1316A型柱温箱,Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(70∶30,v/v),流速1.0 mL/min,进样量10 μL。制备采用岛津LC-6A高压半制备液相色谱仪,配置YMC色谱柱(20 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(65∶35,v/v),流速10.0 mL/min。检测波长均为254 nm。

2 结果与分析

2.1 石菖蒲有效部位的高压半制备液相色谱分离结果

本实验采用不同洗脱条件、不同进样体积对α-细辛醚和β-细辛醚进行分离,结果发现,采用甲醇-水体系作为流动相,甲醇的比例越高,α-细辛醚和β-细辛醚的保留时间越短,可缩短两种产物的制备周期,但两者的分离度下降,从而使产物纯度下降。降低甲醇比例可提高两者的分离度,但同时延长了产物的制备周期,使制备成本上升。在采用半制备液相色谱进行分离纯化时,进样体积同样影响分离效果,过大的进样量使产物峰产生平头峰,从而使保留时间延后,影响分离度,而过小的进样量又达不到制备的目的。通过多次实验表明,当流动相条件为甲醇-水(65∶35,v/v),流速10.0 mL/min时,洗脱时间合适,同时当进样量为200 μL,可实现两个峰的较好分离,最终制备得到β-细辛醚(峰1)和α-细辛醚(峰2),纯度分别为99.43%和99.08%,半制备液相色谱图和制备产物液相色谱图分别见图2、图3。

图2 石菖蒲挥发油提取液的高压半制备液相色谱图Fig.2 Chromatogram of semi-preparative HPLC of volatile oil extract of Acorus tatarinowii Schott注:峰1:β-细辛醚,峰2:α-细辛醚。

2.2 结构鉴定结果

化合物1(图2-峰1):EI-MS:m/z 208[M]+,193[M-CH3]+,165[M-CH3CO]+,162.1[M-CH3HOCH2]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.86(3H,dd,J=1.5,7.5 Hz,H-3′),3.82,3.86,3.91(each,3H,s,OCH3),5.77(1H,dq,J=7.2,11.4,H-2′),6.46(1H,dq,br d,H-1′),6.55(1H,s,H-3),6.88(1H,s,H-6)。13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:14.7(C-3′),56.1(OCH3),56.4(OCH3),56.6(OCH3),97.5(C-3),114.1(C-6),118.0(C-5),124.8(C-2′),125.8(C-1′),142.4(C-1),148.5(C-2),151.5(C-4)。通过与文献[12]比较,化合物1被鉴定为β-细辛醚(β-asarone)。

化合物2(图2-峰2):EI-MS:m/z 208[M]+,193[M-CH3]+,165[M-CH3CO]+,162[M-CH3HOCH2]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.87(3H,dd,J=1.2,7.2 Hz,H-3′),3.81,3.85,3.88(each,3H,s,OCH3),6.12(1H,dq,J=6.6,15.6,H-2′),6.67(1H,dq,br d,H-1′),6.50(1H,s,H-3),6.96(1H,s,

图3 石菖蒲挥发油及纯化物的液相色谱图Fig. 3 HPLC chromatograms of the volatile oil extract of Acorus tatarinowii Schott and the purified products注:A:石菖蒲挥发油提取物,B:β-细辛醚,C:α-细辛醚。

H-6)。13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:18.8(C-3′),56.1(OCH3),56.5(OCH3),56.7(OCH3),97.9(C-3),109.7(C-6),119.0(C-5),124.3(C-2′),125.0(C-1′),143.3(C-1),148.7(C-2),150.6(C-4)。通过与文献[13]比较,化合物2被鉴定为α-细辛醚(α-asarone)。

3 结论

本文首次采用高压半制备液相色谱法对石菖蒲药材的主要有效成分β-细辛醚和α-细辛醚进行一步式分离纯化,该方法操作简单、制备量大、产物纯度高,可用于石菖蒲中高纯度β-细辛醚和α-细辛醚对照品的制备。

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Preparation of high purityβ-asarone andα-asarone fromAcorustatarinowiiSchott

QIU Ji-ying1,ZHAO Shuang-zhi1,ZHAO Yu-zhong2,CHEN Lei-lei1,WANG Tong-yan1,WANG Wei-ming1,*

(1.Institute of Agro-Food Science and Technology & Shandong Provincial Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100,China; 2.Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)

To establish a method for preparation of high purityβ-asarone andα-asarone fromAcorustatarinowiiSchott by high pressure semi-preparative liquid chromatography,its volatile oil was prepared fromAcorustatarinowiiSchott,and a semi-preparative high performance liquid chromatography was used to refine and purifyβ-asarone andα-asarone with a solvent composed of methanol and water(65∶35,v/v). The structures of product were identified by EI-MS,1H-NMR and13C-NMR,and their purities reached 99.43% and 99.08%,respectively. The method is easily operated,with high purity and preparation amount. It is suitable for high purityβ-asarone andα-asarone reference material preparation fromAcorustatarinowiiSchott.

AcorustatarinowiiSchott;high pressure semi-preparative liquid chromatography;β-asarone;α-asarone;purification

2016-12-27

裘纪莹(1981-)，女，硕士，助理研究员，主要从事农产品加工方面的研究，E-mail：qjyfood@163.com。

*通讯作者:王未名(1957-)，男，学士，研究员，主要从事农产品加工方面的研究，E-mail：wweiming@163.com。

山东省自然科学基金三院联合基金项目(ZR2014YL020)；山东省农业科学院青年科研基金项目(2014QNM47)；泰山学者建设工程专项。

TS201.1

A

1002-0306(2017)07-0293-03

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.048