严美婷,董开发,曲旭龙,陈卫平,张超凤,张凤英

(江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045)

日常用胶带和标签纸上溶血细菌的分离鉴定

严美婷,董开发,曲旭龙,陈卫平,张超凤,张凤英*

(江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045)

评估生活中日常用胶带和标签纸的安全风险性,并对各样本上的溶血细菌进行分离及鉴定。采集日常生活中经常用到的胶带、标签纸,无菌操作剪取一小块贴于血平板上置于35～37 ℃培养,用作业本、打印纸、新闻纸等常用纸张做对照,24～48 h后通过观察溶血圈的大小来判断各种样本上微生物的溶血性的强弱,据此评估该样本的安全风险性;对各种样本上微生物菌落进行分离纯化,再通过革兰氏染色、观察细胞形态、生理生化实验和16S rDNA测序对其进行菌属鉴定。结果表明,所测定的样本上的溶血菌均为芽孢杆菌属中的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),且菌来源于样本的胶质层。日常用的各种胶带、标签纸都存在一定的潜在的微生物安全风险。

溶血性,胶带,标签纸,鉴定,解淀粉芽孢杆菌

胶带、标签纸及儿童贴纸等在日常生活中应用广泛,然而这些产品均存在一定的潜在的微生物安全风险,将微生物实验室的标签纸直接贴于血平板上,其中培养基上标记着不同的金黄色葡萄球菌株,经培养了1 d后观察发现:几株金黄色葡萄球菌株均未出现溶血圈,而在标签纸的周围却有明显溶血圈。因此笔者采集了日常生活中经常用到的各种胶带(包括超市捆绑蔬菜的胶带)、标签纸、个性贴纸做溶血菌微生物调查,并用作业本、打印纸、新闻纸等常用纸张做对照,评估这类产品的潜在微生物安全风险性。再对各种样本上溶血菌落进行分离纯化,通过革兰氏染色、测定细胞大小、嗜盐性实验等生理生化实验和分子生物学对其进行菌属鉴定。以此可为评估胶带、标签纸等产品是否存在潜在的微生物安全风险性提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

透明胶(宽度为1.0、4.0 cm)、双面胶(宽度为1.0、1.5、2.0 cm)、捆扎蔬菜胶带(宽度为1.0、2.0 cm)、标签纸(宽度为1.0、2.5 cm)各一卷、儿童贴纸(海绵宝宝和动物头像)各一页 超市购买或采集;作业本、打印纸、新闻纸、信封牛皮纸、卫生纸、课本、透明包装塑料纸 笔者办公室搜集；哥伦比亚血琼脂平板、杆菌肽纸片 上海科玛嘉维生物技术有限公司;牛肉膏、蛋白胨、琼脂、肌醇、甘露醇、木糖、果糖 生化试剂;氯化钠 分析纯。

HH-BLL-600电热恒温培养箱 上海跃进医疗机械厂;AR214电子天平 奥豪斯国际贸易有限公司;MJ-54A高压蒸汽灭菌锅 施都凯仪器设备有限公司;XSP-103B生物显微镜 宁波永新光学股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 各种培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.5 g,蛋白胨1 g,氯化钠0.5 g,琼脂2 g,蒸馏水100 mL,pH7.0～7.5。

土豆培养基的制备:马铃薯20 g,葡萄糖2 g,琼脂1.5～2 g,水100 mL,马铃薯去皮切片,煮20 min后取汁,加葡萄糖、琼脂、水溶解分装灭菌。

1.2.2 样本溶血性细菌的检测 在无菌操作条件下将样本的外层表面和侧边缘用75%的乙醇消毒,然后剪成长1 cm,宽0.5 cm的长方形贴在血平板上,每个血平板贴三到四小块均匀分开,盖好盖,放入培养箱35～37 ℃培养1～4 d,观察样本周围是否有溶血圈,溶血圈越大,说明菌多或菌的溶血性较强。

1.2.3 分离纯化 先划线分离,再稀释分离。

1.2.4 革兰氏染色 涂片、固定→初染→媒染→脱色→复染→镜检。

1.2.5 菌体大小 用显微镜和显微测微尺测定。

1.2.6 嗜盐性实验 将溶血菌接入含NaCl 6.5%的营养肉汤试管里恒温培养1～2 d,观察菌是否能生长。

1.2.7 菌株运动性检测 用接种针挑取待检菌体垂直穿刺接种到营养琼脂半固体培养基,至距管底3～5 mm为止,从原路退回,放在恒温培养箱培养。如果菌体沿穿刺线扩散生长,则菌株具有运动能力。

1.2.8 杆菌肽敏感性实验 将待检菌纯培养物菌液稀释至合适浓度均匀涂布于营养琼脂平板上,以未接种菌液的培养基上作对照组,然后贴上0.04 U/片的杆菌肽纸片,35 ℃培养18～24 h,观察纸片周围是否有抑菌圈。

1.2.9 生理生化实验 糖分解实验、吲哚实验、V-P实验、M-R实验[1]。

1.2.10 分子生物学鉴定 将分离纯化得到的菌株交由青岛科标检测研究院有限公司进行测序。然后将目标序列在NCBI中查找同源序列,进行blastn比对,从中选出相似性在99%以上的几个序列进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 各种胶带、标签纸、纸张在血平板培养现象

2.1.1 各种胶带溶血菌潜藏状况 将透明胶(宽度为1.0、4.0 cm)、双面胶(宽度为1.0、1.5、2.0 cm)、超市蔬菜捆扎胶带(宽度为1.0、2.0 cm)贴于血平板培养,培养24～48 h后,胶带周围均长有灰色的菌苔,菌苔颜色形态基本一致,菌苔周围或环侧有1～10 mm的透明溶血圈。培养48 h后溶血圈明显变大,血平板颜色变浅,说明菌繁殖越多,溶血能力越强。其中宽度为1.5 cm和2.0 cm双面胶贴在血平板上培养24 h后虽无明显溶血圈,但培养48 h后菌落外沿出现了1～2 mm宽度的溶血圈,并且培养72 h 溶血圈直径继续变大,表明该规格双面胶初始含菌量较少。因此可知各种规格透明胶、双面胶、蔬菜捆扎胶带上均潜藏溶血细菌,一遇上合适的条件就会迅速繁殖。结果如图1所示。这提示人们在手上皮肤有创口时最好不要使用或带手套使用各种胶带可减少伤口感染化脓的几率。

图1 各种胶带上溶血细菌的检测结果Fig.1 The test result of hemolytic bacteria of all kinds of adhesive tape注:图片结果为培养48 h,图2、图3同。

2.1.2 标签纸、儿童玩具贴带菌状况 将标签纸、儿童玩具贴直接贴于血平板上培养24 h的贴标签纸血平板上有1～2 mm的明显溶血圈,随着培养时间的延长溶血圈直径也变大,当培养48 h后溶血圈超过10 mm,溶血现象明显,整个血平板颜色变淡,且菌苔形态类似上述胶带的溶血菌,表面无其它菌落生长,现象见图2。故可判断标签纸、儿童玩具贴上也存在溶血细菌。

图2 标签纸上和玩具贴上溶血细菌的检测结果Fig.2 The test result of hemolytic bacteria of label paper and toys stickers

2.1.3 各种纸张带菌状况 有人会质疑胶带,标签纸,儿童贴上的类似溶血菌有可能是空气中的,不一定是胶质层的,因此本实验采集了日常用的各种纸张如作业本、打印纸、卫生纸(新、旧卫生纸)、报纸(新、旧报纸)及透明包装塑料纸等来做检测作为对照。结果发现作业本、书、A4打印纸、牛皮纸信封、新卫生卷纸及透明包装塑料纸均没有溶血菌;而新、旧报纸、旧卫生纸有溶血菌,新报纸、旧卫生纸结果见图3。

图3 各种纸张上溶血细菌的检测结果Fig.3 The test result of hemolytic bacteria of all kinds of paper

结果表明新卫生纸没有溶血菌,而旧卫生纸有溶血菌,这是因为卫生纸是再生纸,一些耐热菌和芽孢很难杀死,时间长了卫生纸容易受潮,受潮后芽孢菌易萌发,因此旧卫生纸上有溶血菌,危害性较大。由于新闻纸也易吸潮,不能满足标签纸和玩具贴的功能性,因此一般标签纸和玩具贴是不用报纸这一类的新闻纸生产的,故我们可得出标签纸和玩具贴上的溶血菌由胶质层带入的可能性较大;贴有透明包装塑料纸的血平板中没有出现溶血圈,说明胶带上的溶血菌也应该可能是胶质层里的。

2.2 分离纯化

将透明胶和双面胶上具有溶血作用的菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上多次划线和稀释分离后培养24 h,发现所有样本上的优势菌株菌落特征均相同,为:米白色、微凸、表面光滑、圆形、不透明。然后将它们再次接到血平板上培养24 h,发现均有明显的溶血作用,并在血平板上菌落显灰色,表面粗糙不透明。

将分离纯化得到的所有样本的溶血菌进行革兰氏染色,发现均为阳性菌,培养8～12 h后菌体呈杆状,两端钝圆,杆状成对或单个排列,24～48 h后菌体呈短杆状,单个分布,菌体大小为(1.4～2.1) μm×(0.4～0.5) μm。因此从形态上可看出,该溶血菌不是溶血性链球菌、葡萄球菌和副溶血性弧菌。结果见图4。

图4 菌落形态和菌体形态图Fig.4 Colony morphology and cell morphology

2.3 生理生化实验

不同细菌具有不同的酶系统,分解利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力也不同,故导致其发酵的类型和产物也不相同,即使是在分子生物学技术和手段不断发展的今天,细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中依然起着较大作用。

2.3.1 嗜盐性实验 将分离纯化得到的溶血菌进行嗜盐性实验,结果发现菌株生长良好,溶液浑浊,说明该菌具有耐高盐的特性。

2.3.2 穿刺实验 将溶血菌进行穿刺接种实验,结果发现菌沿穿刺线呈松散状扩散生长,呈倒立的伞状,说明该菌株有运动能力。

2.3.3 杆菌肽敏感性实验 将溶血菌进行杆菌肽敏感性实验,结果发现在接有菌液的培养基上的试纸周边出现了明显抑菌圈,而对照组没有,现象见图5,说明该溶血菌对杆菌肽敏感。

图5 杆菌肽敏感性检测结果Fig.5 Detection results of bacitracin sensitivity

2.3.4 糖发酵及其它生化实验 生化实验结果见表1,从中发现不同样本分离到的溶血菌生化实验结果基本一致,说明它们是同一种属的细菌。将菌体的形态特征和生化实验结果与《伯杰细菌鉴定手册》中溶血菌进行比对,可以把溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌[2]、溶血性大肠杆菌[3]、李斯特菌[4-5]逐个排除。

表1 生理生化鉴定结果Table 1 Results of physiological and biochemical identification

注:“+”代表结果为阳性;“-”代表结果为阴性。

2.4 分子生物学鉴定

将分离纯化得到的溶血菌进行基因测序,并将得到的基因序列通过BLAST进行同源序列检索[6]发现,与该菌株同源性最高的前10个菌株中有6个为解淀粉芽孢杆菌,且基因同源性均在99%以上。菌株BacillusamyloliquefaciensAF489591与该菌株差异性最小,同源性水平最高。因此,分离纯化得到的溶血菌与BacillusamyloliquefaciensAF489591的亲缘关系最近,结合其形态学特征及生理生化实验结果,可以鉴定得出该溶血菌菌株为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。

3 结论与讨论

目前发现具有溶血性的菌有溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、溶血性大肠杆菌、李斯特菌、解淀粉芽孢杆菌[7]。本实验对从透明胶、双面胶上的溶血细菌进行了分离纯化,再经过显微镜观察菌体形态可知该溶血菌不是溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌;经嗜盐性实验排除溶血性大肠杆菌;经生理生化实验确定不是李斯特菌,最终经分子生物学鉴定确定该溶血菌为解淀粉芽孢杆菌。

虽然过去有不少资料把解淀粉芽孢杆菌作为一种提取抑菌剂或发酵保鲜液的有益细菌来研究开发[8-9],并在食品、医药、工农业生产中都有所应用,被认为是无毒素和无致病性。但近年来也有报道称该菌会污染空气和食品,造成特殊人群皮肤破损或免疫力低下人群的感染,其“无毒”和“无致病性”已经受到质疑[10-11],相关研究认为,此菌为条件致病菌[12-13]。该菌可污染医院75%酒精消毒液[14-15]、潮湿损害的房屋、食品,造成新生儿、婴幼儿等免疫力低下的特殊人群感染健康综合征[15-16]。这些危害与本文实验得到的结论——日常用的各种胶带、标签纸都存在一定的潜在的微生物安全风险相对应。

结合本研究实验结果得出,日常用的手机贴、水果标签贴、儿童玩具贴和蔬菜捆绑带等各种胶带、标签纸都存在一定的潜在的微生物安全风险,它们的胶质层里可能带有解淀粉芽孢杆菌,使用时易使皮肤破损或免疫力低下者感染致病。因此发表本文以期引起消费者及相关把解淀粉芽孢杆菌作为有益菌研究的科研工作者和临床上的重视。

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Isolation and identification of hemolytic bacteria on common adhesive tape and label paper

YAN Mei-ting,DONG Kai-fa,QU Xu-long,CHEN Wei-ping,ZHANG Chao-feng,ZHANG Feng-ying*

(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

To assess the adhesive tape and label paper security risks in daily life,and to separate and identify the hemolytic bacteria of the samples. The adhesive tape and paper label were collected in commonly daily life,and a small piece of the samples were sheared on the blood plate with aseptic technique,cultivated at 35～37 ℃,and the comparisons were workbook,printing paper,newsprint and other commonly used paper. The strength of the microbial hemolytic were judged by observing the size of hemolysis circle of the samples after 24～48 hours cultivating,and the safety risks of the samples were also assessd. The samples were separated and purified on microbial colony,and through the gram stain,observiation of cell morphology,physiological,biochemical test and 16S rDNA sequencing,the species were identificated. Results showed that the hemolytic bacterium of samples for determination isBacillusamyloliquefaciens,and it comes from glial layer of the samples. To some degree,daily adhesive tapes,label papers have potential microbial security risks.

hemolytic;adhesive tape;label paper;identification;Bacillusamyloliquefaciens

2016-10-24

严美婷(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：1303028648@qq.com。

*通讯作者:张凤英(1964-)，女，本科，研究员，研究方向：食品微生物、食品工程，E-mail：3q3w3q3w@163.com。

TS201.6

A

1002-0306(2017)07-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.046