苏 龙,梁广波,吕凤丹,冯 露,严素萍,王雪儒

(玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林 537000)

响应面优化酶法水解京尼平苷工艺

苏 龙,梁广波,吕凤丹,冯 露,严素萍,王雪儒

(玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林 537000)

目的:优化京尼平苷的酶解工艺。方法:以京尼平含量为响应值,在单因素实验基础上,以酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH为实验因素,采用响应面法建立数学模型,筛选最佳酶解工艺条件。结果:通过二次回归模型响应面分析,影响京尼平苷酶解的因素按主次顺序排列为:酶添加量>酶解温度>pH>酶解时间;确定京尼平苷酶解最佳工艺条件为酶添加量6.6 mL(约140 U),酶解温度56.5 ℃,酶解时间150 min,pH4.0,此条件下京尼平含量为4.66 mg/mL,模型方程理论预测值为4.80 mg/mL,两者相对误差小于3%。结论:采用响应面法优化得到了京尼平苷酶解的最佳工艺,该工艺方便可行。

京尼平苷,京尼平,β-葡萄糖苷酶,响应面,优化

京尼平(Genipin)是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物,是一种优良的天然生物交联剂,可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料,如人造骨骼、伤口包扎材料等,其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂[1]。也可用于治疗肝脏疾病、降压、通便;京尼平还可以缓解II型糖尿病的症状[2-5]。京尼平在自然界中的含量很少,直接提取十分困难。孙步祥等[6]发明了一种从桅子中提取京尼平苷及京尼平的制备方法,通过提取、浓缩、冷冻干燥等步骤制得京尼平,纯度为90%以上。该法提取工艺复杂,且提取过程使用有机溶剂不利于产品的质量。目前,京尼平的生产多使用酶解法,即直接利用β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷转化生产京尼平。杨丹等[7]从桅子中分离得到高纯度(99.5%)的京尼平苷,然后经过酶水解京尼平苷20h,京尼平苷的转化率达90%。目前的研究大部分是使用商品化的纯酶,价格昂贵,生产成本比较高。本实验利用自行筛选到的高产β-葡萄糖苷酶菌株罗尔夫青霉PenicilliumrolfsiiHXL发酵产生的粗酶液直接水解京尼平苷,并采用响应面法探讨粗酶水解京尼平苷获得京尼平的最佳工艺条件,节省了酶的纯化,为进一步利用该菌株与中草药桅子粉共发酵来生产京尼平提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗尔夫青霉HXL(Penicilliumrolfsii) 本实验室分离保藏；京尼平苷(纯度99%)、京尼平苷(纯度90%以上) 成都康邦生物科技有限公司;其它试剂 均为分析纯，国药集团化学制剂有限公司；粗酶 罗尔夫青霉HXL发酵获得；产酶培养基 麸皮3%,酵母膏4 g/L,KH2PO40.2%水杨苷 0.05%,KH2PO40.2 g/L,醋酸钠0.1 g/L,抗坏血酸0.1 g/L,MgSO40.1 g/L,pH自然,分装121 ℃灭菌20 min。

Tu21800 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HH-s数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂;FE20 Five Easy实验室pH计、AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验条件

1.2.1 京尼平标准曲线的绘制 精密称取京尼平标准品0.5 mg(精确至0.0001 g),用蒸馏水溶解于5 mL试管中,稀释到刻度、摇匀,加入0.2 mol/L 5 mL精氨酸,定容至10 mL,然后100 ℃显色反应10 min,冷却后分别吸取此液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL试管中,加蒸馏水稀释到刻度、摇匀,所得浓度为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μg/mL的溶液,以蒸馏水为参比,在λ=590 nm下进行检测,在此波长下测定不同质量浓度京尼平标准液的吸光度[8-9]。

1.2.2 京尼平的测定 取酶解液,8000 r/min离心10 min,取其上清液(即含京尼平)2 mL,加入2 mL 0.2 mg/mL的精氨酸溶液,定容至10 mL,100 ℃显色反应10 min,590 nm测其吸光度值[8-9]。

1.2.3β-葡萄糖苷酶粗酶液制备 将保藏的罗尔夫青霉HXL接种至查氏培养基,于30 ℃培养箱培养5 d,在超净工作台内用10 mL无菌水洗脱菌株孢子,制备菌悬液,用移液枪吸取5 mL菌液接入到产酶培养基(250 mL三角瓶装75 mL培养液),30 ℃,摇床180 r/min,培养144 h。取出发酵液,8000 r/min离心10 min,得到上清液(即粗酶液)。

1.2.4 酶解单因素实验 用pH4.0的缓冲液配制浓度为10 g/L的京尼平苷底物,加入粗酶液于一定条件下水浴保温一定时间,然后测量京尼平的含量。

以京尼平含量为依据,在底物浓度10 g/L及其它参数不变条件下,分别考察酶添加量(2、4、6、8、10 mL粗酶液,粗酶液酶活为21 U/mL),酶解温度(45、50、55、60、65 ℃),pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)、酶解时间(60、90、120、150、180 min)对京尼平产量的影响。

1.2.5 响应面优化设计 依据单因素实验结果,选择酶添加量、酶解温度、酶解时间、pH为自变量,根据Box-Behnken设计,进行四因素三水平的响应面分析实验,以京尼平含量为响应值,利用Design Expert8.06软件对数据进行分析,因素水平设计见表1。

表1 响应面因素设计及水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 数据统计分析

本文作图采用OriginPro 8.5软件,响应面分析设计采用Box-Behnken软件,利用Design Expert 8.06软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 京尼平标准曲线测定

根据所获得的不同京尼平标准品浓度的吸光度,做出京尼平标准曲线,如图1所示。

图1 京尼平标准曲线Fig.1 The standard curve of genipin

京尼平标准曲线的线性回归方程及相关系数为y=0.0197x-0.0015，R2=0.9954,说明该曲线具有一定的线性关系,检测线性范围为0.590～4.783 μg/mL,后续的实验可以用该方程计算京尼平的含量。

2.2 酶的添加量对转化京尼平苷的影响

由图2可知,当酶添加量增加到4 mL(约80 U)时,京尼平含量达到3.87 mg/mL,随着酶添加量的进一步增加,京尼平含量没有增加,说明在该底物浓度下,酶浓度已经趋于饱和,继续添加酶液,对京尼平含量没有影响,故酶添加量为4 mL。

图2 酶添加量对京尼平苷转化的影响Fig.2 Effect of enzyme concentration on the geniposide biotransformation

2.3 酶解温度对京尼平产量的影响

结果如图3所示,当酶解温度为55 ℃时,京尼平含量达到3.93 mg/mL;继续提高酶解温度,当酶解温度为60 ℃时,京尼平含量反而减小,这是因为温度过高导致酶活力下降;而杨丹等[7]采用诺维信的β-葡萄糖苷酶酶解温度为30 ℃,酶解时间大大延长,效率下降。故最佳酶解温度选择55 ℃。

图3 酶解温度对京尼平苷转化的影响Fig.3 Effect of enzymlysis temperature on the geniposide biotransformation

2.4 酶解时间对京尼平产量的影响

由图4可知,当酶解时间大于150 min后,京尼平含量达到最大值,因为酶解时间过长,酶的催化活性下降,进而对京尼平苷的转化影响不大,故最佳酶解时间选择150 min;而杨丹等[7]采用诺维信的β-葡萄糖苷酶酶解时间为20 h,酶解时间大大延长,效率下降。

图4 酶解时间对京尼平苷转化的影响Fig.4 Effect of enzymlysis time on the geniposide biotransformation

2.5 pH对转化京尼平苷的影响

由图5可见,当溶液为pH4.0时,京尼平含量达到3.97 mg/mL;pH大于或小于4.0,京尼平苷的转化率都下降,故最佳酶解pH选择4.0。

图5 pH对京尼平苷转化的影响Fig.5 Effect of different pH on the geniposide biotransformation

2.6 响应面优化实验

2.6.1 响应面实验结果 实验方案及实验结果见表2,回归模型方差分析见表3。

表2 响应面实验方案及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

2. 6.2 结果分析及模型方程的建立 对表3中数据进行回归拟合,得到自变量与京尼平含量(Y)的二次多项回归方程为:

Y=4.61+0.67A+0.31B+0.055C+0.28D+0.078AB-0.05AC-0.033AD+0.1BC-0.01BD-0.14CD-1.01A2-0.55B2-0.25C2-0.69D2

对该模型进行方差分析,结果如表3所示,该回归模型p<0.0001,方程模型达到极显著,失拟项p=0.1126>0.05,不显著;该回归模型的总决定系数R2=0.9556,调整决定系数R2Adj=0.9112,变异系数CV=6.57,以上参数均说明该模型拟合程度好,实验误差小,故该回归方程模型成立,可以用此模型对京尼平苷酶解条件进行分析及预测。

2.6.3 响应面分析 实验的各因素方差分析如表3所示。由表3可知,模型一次项A(酶添加量)、B(酶解温度)、D(pH)极显著,C(酶解时间)不显著;二次项A2、B2、D2均处于极显著水平,C2为处于显著水平;交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD均不显著。在各影响因素中,A(酶添加量)对京尼平苷酶解的影响最大,其次是B(酶解温度)、D(pH)和C(酶解时间)。在总的作用因素中,一次项和平方项的影响较大,而交互项的影响较小。经Design-Expert 8.0.6优化,通过对回归模型求解方程并考虑实际操作的可行性,修正得出京尼平苷酶解最佳条件为:酶添加量6.6 mL,酶解温度56.5 ℃,酶解时间150 min,pH4.0,在此条件下京尼平含量的预测值为4.80 mg/mL。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

注:*p<0.05,差异显著;**p<0.001,差异极显著。

2.6.4 验证实验 为检验响应面法优化后的工艺可靠性,在上述最佳酶解条件下,进行3组平行实验,所得京尼平含量均值为4.66 mg/mL,与理论预测值的相对误差为2.92%,说明运用响应面法优化得到的模型参数准确可靠,能真实地反映各因素对京尼苷酶解的影响。

3 结论与讨论

通过单因素实验和响应面实验确定了酶法水解京尼平苷获得京尼平的最佳工艺条件为:酶添加量6.6 mL,酶解温度56.5 ℃,酶解时间150 min,pH4.0,此条件下京尼平含量为4.66 mg/mL,而回归方程所得的京尼平含量理论预测值为4.80 mg/mL,两者相对误差为2.92%。此外,影响京尼平苷酶解的因素按主次顺序依次为:酶添加量>酶解温度>pH>酶解时间。

本文通过单因素和响应面实验法对酶解法水解京尼平苷转化京尼平的条件进行了优化,在最优条件下,京尼平含量达到4.66 mg/mL,比付岩[10]等人利用泡盛曲霉发酵生产京尼平,产量8.5 g/L低,而且酶活也比较低,相信经过对罗尔夫青霉菌进行改造,利用该菌株分泌的β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷产生京尼平还是具有很好的应用前景,也可以利用该菌株与中草药栀子粉共发酵生产京尼平。另外,由于本实验中用到酵母膏,发酵获得的粗酶液中还具有一定的氨基酸,酶解出来的京尼平与其中的氨基酸反应形成了栀子蓝素,使得京尼平的产量也受到一定的影响;为了解决这个问题,有研究者利用耐有机溶剂的β-葡萄糖苷酶进行两相催化反应转化京尼平苷产生京尼平[11-12],或者利用固定化细胞发酵生产京尼平[13],取得比较好的效果;这给本研究提供了很好的思路,可以通过菌株的选育,把罗尔夫青霉改造成耐有机溶剂的菌株,可以通过两相发酵法来避免发酵产生的京尼平与培养基中的氨基酸或者蛋白质起不可逆的反应,提高京尼平的产量。同时也可以对罗尔夫青霉产生的β-葡萄糖苷酶进一步改造其催化特性,尤其是对不溶性活性成分催化活性的改造,是对中草药资源研究和中医药产业发展的一项重要内容,具有重大的现实意义。

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Optimization of enzymlysis conditions of geniposide using response surface methodology

SU Long,LIANG Guang-bo,LV Feng-dan,FENG Lu,YAN Su-ping,WANG Xue-ru

(College of Biology & Pharmacy of Yulin Normal University,Yulin 537000,China)

Objective:This study aimed to optimize the enzymlysis conditions of geniposide. Method:Genipin concentration as response value,the experimental factors including enzyme concentration,enzymlysis temperature,pH and enzymlysis time were investigated to optimize the enzymlysis conditions of geniposide,and the mathematical mode was established by response surface method(RSM). Result:The optimum conditions obtained by RSM were as follows,genipin yield was most significantly affected by enzyme concentration,followed by enzymlysis temperature,pH and enzymlysis time. The concentration ofβ-glycosidase was 6.6 mL(140 U),enzymlysis temperature was 56.5 ℃,pH was 4.0,enzymlysis time was 150 min. Under the optimal conditions,the predicted genipin concentration by mathematical model was 4.80 mg/mL,while the experimental concentration was 4.66 mg/mL,with a difference of less than 3%. Conclusion:The optimum enzymlysis conditions of geniposide by RSM was convenient and feasible.

geniposide;genipin;β-glucosidase;response surface;optimization

2016-10-28

苏龙(1978-)，男，硕士，副教授，研究方向：工业微生物及发酵工程，中草药微生物转化，E-mail:gxsulong@163.com。

广西自然科学基金项目(青年项目)(2013GXNSFBA019178)；广西高校科学技术研究项目(一般项目)(2013YB195)；广西大学生创新创业训练项目(201610606027)；广西高等教育本科教学改革工程项目(2015JGB351)；玉林市科学研究与技术开发计划项目(玉市科攻1621021)。

TS201.3

B

1002-0306(2017)07-0226-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.036