王彦多,刘春雨,吕世洁,王 颖,王立娜,王集会

(1.山东中医药大学药学院,山东济南 250355; 2.山东中医药大学实验中心,山东济南 250355)

正交实验法优化发酵蜈蚣粉中总黄酮提取工艺

王彦多1,刘春雨1,吕世洁1,王 颖1,王立娜1,王集会2，*

(1.山东中医药大学药学院,山东济南 250355; 2.山东中医药大学实验中心,山东济南 250355)

目的:采用正交实验法优化发酵蜈蚣粉总黄酮回流提取工艺。方法:在对发酵蜈蚣粉中总黄酮提取条件进行单因素实验的基础上,以提取温度(A)、料液比(B)和提取时间(C)为自变量,发酵蜈蚣粉总黄酮得率为因变量,利用正交实验法探究最佳提取工艺条件。同时采用MTT体外抗肿瘤实验方法,研究发酵蜈蚣粉提取物对肺腺癌A549细胞的抑制作用。结果:影响发酵蜈蚣粉总黄酮得率提取因素的大小次序为:料液比>提取温度>提取时间,在此次实验中,发酵蜈蚣粉最佳提取工艺为:提取温度80 ℃,料液比1∶40 (g∶mL),提取时间2.5 h,在此条件下发酵蜈蚣粉中总黄酮得率为1.970%;提取获得的不同浓度的发酵蜈蚣醇提液对肺腺癌A549细胞的抑制率均大于顺铂,具有较优良的抗肿瘤活性。

发酵蜈蚣粉,正交实验,回流提取,总黄酮,MTT法,肺腺癌A549细胞株

蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)的干燥体。辛,温;有毒[1]。作为传统中药材,具有息风止痉,解毒散结,通络止痛的作用[2]。现在临床常用于治疗肿瘤、原发性高血压、糖尿病及并发症、神经性头痛、偏头痛等[3-4]。

黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化压力和抑制癌基因表达的作用[5]。而通过使用球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)对蜈蚣进行发酵可以提高蜈蚣中黄酮类物质的含量,增强其解毒散结的功效,还可以较大幅度的改变药性、提高疗效、降低毒副作用[6]。由此本实验采用水浴回流提取法、通过设计正交实验优化发酵蜈蚣粉总黄酮的提取工艺,并对其进行体外抗肿瘤活性研究。为进一步开发利用该中药提供理论依据。目前,对蜈蚣的研究大多聚焦于未发酵蜈蚣,而对发酵类蜈蚣黄酮提取及生物活性研究却鲜有文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦丁对照品 中国医药上海化学试剂公司生产;无水乙醇,亚硝酸钠,六水氯化铝,氢氧化钠等试剂均为分析纯;RPMI-1640培养基、胎牛血清 赛默飞世尔生物制品北京有限公司;胰酶 上海碧云天生物技术有限公司;注射用顺铂 齐鲁制药有限公司;MTT。

本实验所使用的蜈蚣粉 安徽亳州市(批号:20150730),经山东中医药大学药学院高德民副教授鉴定为少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)。发酵蜈蚣粉(批号:20160301)由山东中医药大学化学实验室自制。

肺腺癌A549细胞株 由山东省立医院提供。

UV9100B型紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司;ST 16R高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;FA1004N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;SK-1快速混匀漩涡器 中国 深圳;远红外辐射干燥箱 上海阳光实验仪器有限公司;梅特勒-托利多分析天平 上海先悦机电有限公司;Memmert 二氧化碳培养箱 北京五洲东方科技发展有限公司;EL340i型全自动酶标仪 Molecular Davices。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精密称取芦丁对照品0.0200 g,用60%的乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,静置,得到2 mg/mL芦丁标准溶液[7]。分别取此溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL,分别加入5个干燥的10 mL试管中,加入30%的乙醇至5 mL,再加入0.30 mL 5%的NaNO2溶液,摇匀,静置6 min,加入0.60 mL 10%的AlCl3·6H2O溶液,摇匀,静置5 min,然后加入2.00 mL 4%的NaOH溶液,最后加入30%乙醇定容至10 mL刻度,摇匀。在 510 nm处测定吸光度,以吸光度对浓度做标准曲线。

1.2.2 提取工艺流程 精密称取发酵蜈蚣粉1.0000 g,按料液比加入80%乙醇,回流提取两次,抽滤,取上清液于3000 r/min离心10 min,收集上清液于50 mL容量瓶中定容,置于4 ℃ 冰箱保存备用[8-9]。

1.2.3 单因素实验 以温度、料液比和提取时间三个因素为研究对象,以发酵蜈蚣粉总黄酮得率为指标进行单因素实验。

1.2.3.1 提取温度对总黄酮得率的影响 以发酵蜈蚣粉中总黄酮得率为指标,在固定料液比1∶25(g∶mL)、乙醇浓度80%、提取两次的条件下,考察不同提取温度(60、70、80、90、100 ℃)对总黄酮得率的影响。

1.2.3.2 料液比对总黄酮得率的影响 以发酵蜈蚣粉中总黄酮得率为指标,在固定提取温度70 ℃、回流提取时间1.5 h、乙醇浓度80%、提取两次的条件下,考察不同料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g∶mL)对总黄酮得率的影响[10]。

1.2.3.3 提取时间对总黄酮得率的影响 以发酵蜈蚣粉中总黄酮得率为指标,在固定提取温度70 ℃、料液比1∶25(g∶mL)、乙醇浓度80%、提取两次的条件下,考察不同提取时间(0.5、1、1.5、2、2.5 h)对总黄酮得率的影响。

1.2.4 工艺条件的优化 为了获得以乙醇作为溶剂,回流提取发酵蜈蚣粉中总黄酮的最佳工艺条件,在单因素实验的基础上,以总黄酮得率为指标,设计三因素、三水平的正交实验。

表1 因素水平编码Table 1 Coded of factors and levels

1.2.5 发酵中药蜈蚣中总黄酮得率的计算:

式中:A为吸光度,Y为发酵中药蜈蚣总黄酮得率(%)。

1.2.6 抑瘤实验方法 将处于对数生长期的肺腺癌A549细胞以每孔100 μL接种于96孔培养板,每孔培养前的细胞个数为8×104,预留三个调零孔,调零孔只加不含血清的1640培养基,不加细胞,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后,细胞数增长至整个孔的90%左右,弃掉培养基,调零组、空白对照组加100 μL不含血清的1640培养基,阳性对照组加100 μg/mL的顺铂100 μL,其他给药组每孔分别加入0.125,0.25,0.5,1,2 mg/mL的药物100 μL,每个浓度的药物重复5个孔,其中以发酵蜈蚣醇提液作为对照组。然后细胞在37 ℃、5%二氧化碳培养箱中继续培养。24 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL于培养箱内避光反应4 h。吸去上清液,加入100 μL DMSO,用酶标仪于490 nm测定OD值,按下式计算药物对细胞的抑制率[11]。

细胞抑制率(%)=[1-(加药组OD-调零组)/(空白组OD-调零组)]×100

1.2.7 数据处理 数据用SPSS 17.0单因素方差、多因素方差分析进行处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线实验结果

芦丁对照品溶液在吸光度0.2～0.7 L/(g·cm)线性范围内成良好线性关系,线性回归方程为A=0.9543C,其中A为吸光度,C为黄酮含量(mg/mL),线性相关系数为r=0.9996。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 提取温度对总黄酮提取量的影响 由图1可知,随着提取温度的上升,发酵蜈蚣粉中总黄酮的得率呈现先上升后下降的趋势,温度为80 ℃ 时总黄酮得率达到最大,在提取温度超过80 ℃ 后,总黄酮得率逐渐下降,下降至90 ℃ 后趋于稳定。是因为从较低温度升至 80 ℃,热效率升高,分子运动加快,利于黄酮的破壁溶出;但随着温度的继续升高,会引起黄酮类化合物结构被破坏,部分蛋白凝固从而不利于黄酮溶出,故得率降低。据此,选定70、80、90 ℃ 作为正交实验中提取温度的三个水平[12-14]。

图1 提取温度对发酵蜈蚣粉总黄酮得率的影响Fig.1 The effect of temperature on the yield of total flavonoids

2.2.2 料液比对总黄酮提取量的影响 由图2可知,随着溶剂量的增加,总黄酮得率呈现先升高后平稳的趋势。当料液比低于1∶35 (g∶mL)时,提取总黄酮得率随着料液比的增大而增大,这是因为得率的高低与黄酮向溶剂扩散的难易程度有关,料液比小,溶剂量少,导致两相界面间的浓度差小,不利于黄酮的扩散。但当料液比高于1∶35 (g∶mL)时,提取总黄酮得率随料液比的增大增长趋势明显降低,这说明一定比例的溶剂即可将有效成分提取完全。因此,选定1∶30、1∶35、 1∶40 (g∶mL)作为正交实验中料液比的三个水平[15-17]。

图2 料液比对发酵蜈蚣粉总黄酮得率的影响Fig.2 The effect of solid on the yield of total flavonids

2.2.3 提取时间对总黄酮提取量的影响 由图3可知,随着时间的增加,发酵蜈蚣粉中总黄酮得率在提取时间是0.5～1 h时十分平稳,而从1 h开始明显增高,可见提取时间越长,提取越充分。当提取时间超过2 h后,黄酮得率趋于稳定,可见,当提取时间达到一定长度黄酮溶出量便达到饱和,不再明显溶出。因此,选定1.5、2、2.5 h作为正交实验中提取时间的三个水平[18-21]。

图3 提取时间对发酵蜈蚣粉总黄酮得率的影响Fig.3 The effect of times of extraction on the yield of total flavonoids

2.3 正交实验

根据单因素实验结果,选取影响发酵蜈蚣粉总黄酮提取因素中有意义的水平做正交实验,对结果进行极差分析,以确定最佳提取工艺条件。采用 L9(34)正交因子水平表(见表1),设计L9(34)正交实验,实验结果见表2。

表2 正交实验优化条件下发酵蜈蚣粉中总黄酮得率Table 2 The yield of total flavonoids under orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

注:*表示有显著性差异,p<0.05。

结合文献[22]，由极差和方差分析结果可知,以总黄酮得率为评价指标,进行直观分析发现,各因素对总黄酮提取得率的影响顺序为B>A>C,方差分析表明,因素B对实验结果有显著性影响。因此此次实验回流提取总黄酮的最佳条件为A2B3C3,即料液比为 1∶40 (g∶mL),提取温度为80 ℃,提取时间为2.5 h。

2.4 最佳工艺条件的验证

根据所筛选的最佳工艺条件提取发酵蜈蚣粉3批,按照1.2.1下的方法测定总黄酮得率,实验结果见表4。

表4 验证实验结果Table 4 Verify the experimental results

RSD为1.9%,小于5%,说明该工艺条件稳定可行。

2.5 MTT法测定体外抗肿瘤活性

MTT法测定最佳工艺下发酵蜈蚣粉醇提液对肺腺癌A549细胞的抑制作用结果见图4。

图4 顺铂及不同浓度发酵蜈蚣醇提液对肺腺癌A549细胞的抑制率Fig.4 The inhibition ratio of cis-platinum and different concentration of alcohol extraction of fermented centipede powder to lung adenocarcinoma cell A549

由图4可看出在浓度为0.25 mg/mL后抑制率随浓度的增大不断增大,在不同浓度下发酵蜈蚣醇提液对肺腺癌A549细胞的抑制率均大于顺铂,并且在浓度为2 mg/mL时抑制效果在实验条件下达到最佳。此现象表明蜈蚣醇提液对肺腺癌A549细胞具有较优抑制效果,初步认为是醇提液总黄酮发挥的药理药效,具体原因及是否具有依赖性有待进一步实验研究。

3 结论与讨论

研究表明,黄酮类化合物具有抗炎、抑制癌细胞基因表达的作用[23]。近年来,随着抗肿瘤药理作用研究的不断深入,其在临床抗肿瘤的应用上也更加广泛。对虫类中药的发酵处理能够对中药材中原有的成分进行修饰和转化,或者产生有效的次生代摄物质,从而改变原药性能、产生新的药理作用等。预实验研究表明,发酵可以使中药蜈蚣黄酮极大地增加(相关研究未发表)。因此本实验选用发酵后蜈蚣粉,以总黄酮得率为指标优化其提取工艺并对其进行抗肿瘤作用研究具有一定的创新性。

黄酮不溶于水,易溶于乙醇等有机溶剂,因此本实验主要选用醇溶液提取,而对于其他有机溶剂的提取效果还有待进一步研究。用醇溶液进行提取时,脂溶性物质如黄酮类可被大量溶出,因此以黄酮类化合物得率为指标确定最佳提取工艺。中药提取大多选用80%的乙醇浓度。醇提发酵蜈蚣的主要目的是尽可能全面地提取有代表性的脂溶性成分,超过80%的乙醇浓度就会有多肽和蛋白溶出。因为接下来的实验研究中发酵蜈蚣还要考察水溶性物质的药理活性,所以尽可能地将脂溶性的物质提取出来,同时又尽可能将水溶性的蛋白保留下来,用80%的乙醇进行提取,可以同时兼顾脂溶与水溶物质,其水溶性部分的相关研究有待于今后的进一步推动。

实验采用正交实验法优化发酵蜈蚣粉中总黄酮的提取工艺条件。不同量的溶剂会影响黄酮的溶出量,实验结果表明料液比是影响黄酮提取的关键性因素。用最佳提取工艺,料液比1∶40 (g∶mL),提取时间2.5 h,提取温度80 ℃ 取得的发酵蜈蚣粉中的总黄酮得率为1.970%。通过体外抗肿瘤药理实验证明:蜈蚣醇提液对肺腺癌A549细胞的抑制率均大于顺铂,具有较优良的抗肿瘤效果,蜈蚣醇提液体外对肿瘤细胞的抑制有无剂量依赖关系还有待研究。

本实验采用回流提取的方法,对超声提取、索氏提取及浸渍法提取等其他提取方法的研究还有待进行。近年来,探究蜈蚣体内的抗肿瘤活性成分一直是蜈蚣研究的热点,可能由于蜈蚣醇提液对肺腺癌A549细胞有一定毒副作用,并未于临床大量应用。从目前文献报道来看,蜈蚣的生药学鉴别研究方面还存在不足,整体报道的仅有少棘巨蜈蚣的鉴别研究,对于其他几种蜈蚣的研究则少之甚少,有待于今后在研究中加强。

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Optimization of total flavonoids extraction process in centipede fermentation by orthogonal test

WANG Yan-duo1,LIU Chun-yu1,LV Shi-jie1,WANG Ying1,WANG Li-na1,WANG Ji-hui2，*

(1.College of pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China; 2.The experiment center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,250355,China)

Objective:Orthogonal experiment is used to optimize the extraction process of total flavonoids from fermented centipede powder. Method:Regarding the yield of total flavonoids from fermented centipede as the research index. On the basic of single-factor test,the ultrasonic-assisted extraction process parameters of total flavonoids from fermented centipede including the ratio of extractive temperature(A),the ratio of material(B)and extractive time(C)were optimized by orthogonal test and the yield of total flavonoids was used as the responsive values. The antineoplastic activity of extraction to lung adenocarcinoma cell A549 were measured by using MTT assayinvitro.Result:The order of the effect of these factors on the yield of total flavonoids from fermented centipede powder was the ratio of material>extractive temperature>extractive time. In this experiment,the best extractive process was under 80 ℃ of the extractive temperature,1∶40 (g∶mL) of the ratio of material,2.5 h of the extraction time. Under these conditions,the yield of total flavonoids was 1.970%. The inhibition ratio of different concentration of alcohol extraction of fermented centipede powder to lung adenocarcinoma cell A549 was all greater than cis-platinum,and it had good antineoplasmic activity.

fermented centipede powder;orthogonal test;reflux extraction;total flavonoids;assay of MTT;lung adenocarcinoma A549 cell line

2016-11-11

王彦多(1997-)，女，本科，研究方向：中药学， E-mail：m17864190855@163.com。

*通讯作者:王集会(1962-)，男，本科，副教授，研究方向：虫类中药发酵及活性成分研究，E-mail：wangjihui10@126.com。

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(校编号：2016054，国家编号：201610441048)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0183-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.027