任勰珂,陈 莉,*,卢红梅,佘荣洪,贾青慧2,,张玉梅,白成松

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550025；3.贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳 550025)

多菌种混合固态发酵秸秆的研究

任勰珂1,2,陈 莉1,2,*,卢红梅1,2,佘荣洪3,贾青慧2,3,张玉梅1,2,白成松1,2

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳 550025；3.贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳 550025)

实验以绿色木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillusniger)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、青霉(Penicillium)、长枝木霉(LongibrachiatumRifai)为菌种,在已有单因素实验的基础上选取影响较明显的4个因素(发酵温度、时间、混菌接种量和酵母接入时间)进行固态发酵正交优化实验(其中混菌组合比例均为1∶1∶1),通过测定纤维素酶活、粗纤维素降解率来确定最佳发酵条件。结果表明:以纤维素酶活为指标,酶活最高的是绿色木霉、黑曲霉和假丝酵母三种菌种的组合,其混菌接种量为5%,发酵时间为3 d,酵母与混菌同时接入,发酵温度为30 ℃,纤维素酶活达到85.73 U/mL;以粗纤维素降解率为指标,降解率最高的是长枝木霉、青霉和假丝酵母三种菌种的组合,其混菌接种量为10%,酵母第1 d接入,30 ℃发酵4 d,纤维素降解率达到38.89%。农作物经混菌固态发酵后,营养价值得到提高,可作为一种优质饲料来饲喂家畜,这对于充分利用可再生资源,改善农村环境污染有着积极作用。

秸秆,混合发酵,纤维素酶,固态发酵

秸秆指农作物茎叶部分,主要成分是纤维素、半纤维素和木质素,富含氮、磷等元素[1],是一种非常丰富的可再生资源。我国是秸秆生产大国,年产量7亿多t,约占全世界秸秆总量的20%～30%[2-3]。秸秆多用作饲料、燃料及有机肥料,少部分用作工业原料及食用菌基料[4]。目前,我国普遍采用就地焚烧处理秸秆,不仅污染了环境,还影响群众健康。因此如何优化处理秸秆成为了社会性问题[5],其中微生物发酵是近年来的研究热点,其原理是利用霉菌分泌多种酶类,同时将饲料中纤维物质、淀粉及果胶质等转化为各种糖类[6];或利用酵母菌将秸秆的某些成分进一步合成营养价值较高或适口性较好的物质,如蛋白质、维生素、有机酸、未知生长因子等[7-8]。发酵使秸秆变成质地松软、湿润蓬松、酸香适口的粗饲料,消除了青贮和氨化的不足,有效解决了人畜争粮的问题[9]。

本实验采用产生纤维素分解酶的菌株与酵母菌混合发酵,即同步糖化发酵(SSF)[10]。酵母菌接种量5%,在已有单因素实验基础上,选择发酵温度、发酵时间、混菌接种量及酵母接入时间4个因素进行固态发酵正交优化研究,测定发酵过程中综合因素对酶活的影响及纤维素降解率来确定最佳的发酵条件。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

实验用绿色木霉(Trichodermaviride),黑曲霉(Aspergillusniger),产朊假丝酵母(Candidautilis),青霉(Penicillium),长枝木霉(longibrachiatumRifai) 均由贵州大学化学与化工学院微生物实验室提供,保藏于4 ℃冰箱中;(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CoCl2·6H2O、NaOH 市售,分析纯;稻草秸秆、麸皮 市集，40 ℃恒温烘干,粉碎过60目筛。。

SPX-25013电热生化培养箱、DHG-9140B电热鼓风干燥箱 上海琅轩仪器有限公司;SHZ-82台式恒温振荡器、HH-2数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;LDZH-100KBS立式压力灭菌锅 上海申安医疗器械厂;SW-CJ-1F超净工作台 上海博寻实业有限公司;722S分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;TD4ZWS离心机 北京同德创业科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 DNS试剂:称取DNS 6.3 g,溶解后加2 mol/L NaOH溶液262 mL到500 mL含有185 g酒石酸钾钠(C4H4OKNa·4H2O,M=282.22)的热水中,再加5 g结晶苯酚(C6H5OH,M=94.11)和5 g亚硫酸钠(Na2SO3,M=126.04)搅拌溶解,冷却后稀释至1000 mL容量瓶中混匀,4 ℃保存备用。

葡萄糖标准溶液:将葡萄糖干燥至恒重,称取100 mg蒸馏水溶解后,定容至100 mL。

0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na):称取CMC-Na 5 g,加入适量pH5.0、0.05 mol/L柠檬酸缓冲液,加热溶解定容至1000 mL。

固态发酵培养基:0.5%(NH4)2SO4、0.1%KH2PO4、0.06%CaCl2、0.05%MgSO4·7H2O微量FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CoCl2·6H2O、稻草粉80%、麸皮20%。比例为10 g固体加入20 mL营养液,121 ℃灭菌30 min。

1.2.2 制备菌悬液与标准曲线

1.2.2.1 种子菌悬液的制备 将实验菌株在超净工作台接种到平板上,30 ℃恒温培养72 h。分别挑去平板上的单菌落接种于斜面培养基上,30 ℃恒温静止培养72 h。将菌株纯种分别用无菌水将整个活化斜面洗下后接种到液体种子培养基中(250 mL锥形瓶装液量100 mL,各做两组),30 ℃恒温175～180 r/min振荡培养72 h后得种子菌悬液[11]。

1.2.2.2 葡萄糖标准曲线 按表1规定量,分别吸取葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂于各管中摇匀后同时置于沸水浴10 min,冷却至室温后定溶于20 mL刻度试管中摇匀,在540 nm波长处测其吸光度。以葡萄糖标准液的量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,三次实验的均值获得线性回归方程。

表1 葡萄糖标准曲线配制表Table 1 The configuration of the standard curve of glucose

1.2.3 混合菌固态发酵条件的正交优化 采用同步糖化发酵(SSF),在前期单因素实验基础上,选择发酵温度、时间、混菌接种量和酵母接入时间四个因素进行固态发酵正交优化实验(其中混菌组合比例均为1∶1∶1)。正交水平方案如表2,其他因素为:硫酸铵含量3%,麸皮含量20%,稻草含量80%,含水量为250%[11]。

表2 L9(34)正交实验设计Table 2 L9(34)orthogonal experimental design

1.2.4 纤维素酶活的测定 制备粗酶液:按10 g固体干重加100 mL水,40 ℃,80 r/min浸提1 h,发酵液过滤后在4000 r/min离心20 min,取上清液得到酶液。

测定原理:根据国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的方法,利用纤维素酶能够水解纤维素产生葡萄糖,以5%的CMC-Na溶液作为底物,通过酶的水解成葡萄糖,DNS显色液使还原糖显色,其溶液颜色用分光光度计(540 nm处)测得OD值。借助于标准曲线(图1)计算出葡萄糖的含量,计算公式为已知的标准曲线公式[12]。

步骤:试管中先加入1.5 mL柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH5),加5 mL5%的CMC-Na溶液,振荡混合后,在50 ℃水浴中预热5～10 min后,然后用移液枪加0.5 mL以柠檬酸缓冲液(pH=5)稀释的酶液;保温30 min,加1.5 mL DNS显色液,沸水浴5 min,终止反应,冰水冷却;最后加蒸馏水混合均匀,定容20 mL,等剩余底物完全沉淀后,于540 nm处测光密度值。(以有底物无酶样为空白对照调零)。

酶活定义:在上述条件下每小时,每毫升粗酶液水解底物产生1 μmol的葡萄糖定义为一个酶活力单位[13]。

酶活的计算方法:

式(1)

式中:M-葡萄糖的含量;5.56-1 mg葡萄糖的μ摩尔数(μmol/mL);T-反应时间(h);0.5-酶液加入量(mL);n-酶液稀释倍数;v-固体曲提取液体积(mL);m-固体曲的质量(g)。

1.2.5 粗纤维含量的测定 由贵州大学环境与资源研究所测定,分析方法:粗纤维-酸碱醇醚处理法[14]。

1.3 数据分析

标准曲线及线性回归方程分析采用Excel 2007软件,正交优化实验结果分析采用spss软件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及线性回归方程

分析图1可知,在一定范围内,吸光度随着葡萄糖含量的的增加呈线性上升,线性拟合显示R平方值为0.9980,说明线性相关度较好,可使用在后续分析中。

图1 葡萄糖标准曲线及线性回归方程Fig.1 The standard curve of glucose and the linear regression equation

2.2 固态发酵条件的正交优化

以纤维素酶活为标准进行固态发酵条件的正交优化:

2.2.1 绿色木霉、黑曲霉和假丝酵母组合 由表3可知,极差D>B>C>A,即发酵时间>混菌接种量>酵母接入时间>发酵温度,混菌接种量对酶活影响最大,发酵温度影响最小。正交优化结果:固态发酵条件为D1B1C1A1,即混菌接种量为5%,酵母与混菌同时接入,30 ℃发酵3 d,纤维素酶活达到85.73 U/mL。

表3 纤维素酶活结果分析表Table 3 Analysis of cellulase activity

表4 纤维素酶活结果分析表Table 4 Analysis of cellulase activity

2.2.2 绿色木霉、青霉和假丝酵母组合 从表4可知,极差C>A>D>B,即酵母接入时间>发酵温度>发酵时间>混菌接种量,说明酵母接入时间对酶活影响最大,而混菌接种量的影响最小,正交优化结果:此组合的固态发酵条件为C3A3D2B1,即酵母在混菌接种2 d后接入,36 ℃发酵4 d,混菌接种量5%,纤维素酶活达到72.43 U/mL。

2.2.3 长枝木霉、青霉和假丝酵母组合 从表5可知,极差依次为D>A>C>B,即发酵时间>发酵温度>酵母接入时间>混菌接种量,这说明对酶活影响最大的因素是发酵时间,发酵温度次之,而影响最小的是混菌接种量,正交优化结果:此组合的固态发酵条件为D1A1C2B2,即30 ℃发酵3 d,酵母接入1 d后接入,混菌接种量10%,纤维素酶活达到52.94 U/mL。

表5 纤维素酶活结果分析表Table 5 Analysis of cellulase activity

表6 纤维素酶活结果分析表Table 6 Analysis of cellulase activity

2.2.4 长枝木霉、黑曲霉和假丝酵母组合 从表6知,极差依次为B>A>C>D,即混菌接种量>发酵温度>酵母接入时间>发酵时间,说明在此组合发酵过程中,对酶活影响最大的因素是混菌接种量,发酵温度次之,而发酵时间的影响最小,正交优化结果为B1A2C2D3,即接种量5%,酵母1 d后接入,33 ℃发酵5 d,纤维素酶活达到74.92 U/mL。

以纤维素降解率为标准进行固态发酵条件的正交优化:

2.2.5 绿色木霉、黑曲霉和假丝酵母组合 从表7可看出,极差依次为B>C>A>D,即混菌接种量>酵母接入时间>培养温度>发酵时间,说明在此组合的固态发酵过程,对产粗纤维影响最大的因素是混菌接种量,其次是酵母的接入时间,而发酵时间的影响最小,正交优化结果:固态发酵条件为B3C2A2D1,即接种量15%,酵母1 d后接入,33 ℃发酵时间3 d,粗纤维素降解率达到16.83%。

表7 粗纤维素降解率结果分析表Table 7 Analysis results of curde cellulose degradation rate

表8 粗纤维素降解率结果分析表Table 8 Analysis results of curde cellulose degradation rate

2.2.6 绿色木霉、青霉和假丝酵母组合 由表8知,极差依次为C>D>A>B,即酵母接入时间>发酵时间>培养温度>混菌接种量,说明在此组合的固态发酵过程中,对产粗纤维影响最大的因素是酵母的接入时间,其次为发酵时间以及培养温度,优化结果:固态发酵条件为C1D3A2B1,酵母与混菌同时接入,33 ℃发酵5 d,接种量5%,粗纤维素降解率达到36.45%。

2.2.7 长枝木霉、青霉和假丝酵母组合 从表9看出,极差依次为B>D>C>A,即发酵时间>酵母接入时间>混菌接种量>培养温度,说明此组合的发酵过程中,时间对产粗纤维的影响最大,其次为混菌接种量、培养温度。此组合固态发酵的最优条件为B2D2C2A1,接种量10%,酵母第1 d接入,30 ℃发酵4 d,粗纤维素降解率达到38.89%。

表9 粗纤维素降解率结果分析表Table 9 Analysis results of curde cellulose degradation rate

表10 粗纤维素降解率结果分析表Table 10 Analysis results of curde cellulose degradation rate

2.2.8 长枝木霉、黑曲霉和假丝酵母组合 由表10可知,极差依次为D>A>B>C,即发酵时间>培养温度>混菌接种量>酵母接入时间,说明发酵时间对产粗纤维的影响最大,其次为培养温度及酵母接入时间,正交优化结果:固态发酵条件为D2A2B3C3,混菌接种量15%,酵母在2 d后接入,33 ℃发酵4 d,粗纤维素降解率达到23.53%。

综上,以纤维素酶活为指标,选择的最优组合为绿色木霉、黑曲霉和假丝酵母组合,其正交优化结果为:混菌接种量为5%,酵母与混菌同时接入,30 ℃发酵3 d。以粗纤维降解率为指标:选择的最优组合为长枝木霉、青霉和假丝酵母组合。

3 结论

本实验采用产生纤维素分解酶的菌株(绿色木霉、黑曲霉、长枝木霉和青霉)与酵母菌(假丝酵母)混合固态发酵(混菌比例1∶1∶1),即同步糖化发酵。经优化分析得出:以纤维素酶活为指标,最优组合为绿色木霉、黑曲霉和假丝酵母组合,其正交优化结果为:混菌接种量为5%,酵母与混菌同时接入,30 ℃发酵3 d。以粗纤维降解率为指标:最优组合为长枝木霉、青霉和假丝酵母组合,正交优化结果为:接种量10%,酵母第1 d接入,30 ℃发酵4 d。

在混菌固态发酵过程中,霉菌能分泌多种纤维素酶,它们之间存在着协同作用。酵母可利用农作物秸秆的降解产物单糖、多糖和氨基酸等,并将其转化为蛋白质等其他物质,从而大大提高纤维素酶活性,这促进了秸秆作为饲料在动物体内的消化吸收,提高了秸秆的利用率及营养价值。

[1]张红莲.农作物秸秆饲料处理技术研究进展[J].饲料与畜牧,2004(3):11-16.

[2]王丽,李雪铭,许妍.中国大陆秸秆露天焚烧的经济损失研究[J].干旱地区资源与环境,2008,22(2):170-175.

[3]汪海波,秦元萍,余康.我国农作物秸秆资源的分布、利用与开发策略[J].国土与自然资源研究,2008(2):92-93.

[4]唐萍.秸秆综合利用方案评价一以肥东县为例[D].合肥:合肥工业大学,2010.

[5]赵蒙蒙,姜曼,周柞万.几种农作物秸秆的成分分析[J].材料导报B:研究篇,2011(8):45-57.

[6]董宇,马晶,张涛,等.秸秆利用途径的分析比较[J].中国农学通报,2010,26(19):327-332.

[7]闵晓梅,孟庆翔.白腐真菌处理秸秆的研究[J].饲料研究,2000(9):7-9.

[8]向松明,杨海涛,姚兰.大豆秸秆成分与结构分析[J].湖北造纸,2012(3,4):55-59.

[9]马欢,刘伟伟,刘萍,等.微波预处理对水稻秸秆糖化率与成分和结构的影响[J]. 农业机械学报,2014(10):85-89.

[10张红莲.农作物秸秆饲料处理技术研究进展[J].饲料与畜牧,2004(3):11-16.

[11]王慧杰,李自刚,辛婷,等.多菌种混合发酵玉米秸秆生产含酶蛋白饲料的研究[J]. 湖南农业科学,2011(7):125-128.

[12]石娇蕊,陈玉香.秸秆微生物处理技术的研究进展[J].农产食品科技,2007,1(2):37-41.

[13]汪建中,柯丽霞.混菌固态发酵玉米秸秆提高基质粗蛋白含量的优化培养及相关酶系活性的研究[J].安徽农业科学,2013,41(15):6748-6751.

[14]陈均辉,陶力,李军,等.生物化学实验[M].北京:科学出版社,2003:110-116.

Study on the solid state fermentation of straw with multiple strains

REN Xie-ke1,2,CHEN Li1,2,*,LU Hong-mei1,2,SHE Rong-hong3, JIA Qing-hui2,3,ZHANG Yu-mei1,2,BAI Cheng-song1,2

(1.College of Wine and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550003,China; 2.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province Guizhou University,Guiyang 550003,China； 3.College of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

In this study,Trichodermaviride,Aspergillusniger,Candidautilis,PenicilliumandLongibrachiatumRifaiwere used as fungi,4 factors(fermentation temperature,time,inoculation amount of mixed bacteria and the time of yeast access)were selected on the basis of single factor experiment.The orthogonal experiments of solid state fermentation were carried out(the ratio of mixed bacteria was 1∶1∶1),the optimum fermentation conditions were determined by measuring the cellulase activity and the degradation rate of crude cellulose.The results showed that with cellulase activity as the index,the highest activity of the enzyme was the combination ofTrichodermaviride,AspergillusnigerandCandidautilis,the inoculation amount of mixed bacteria was 5%,fermentation time was 3 days,yeast and mixed bacteria were accessed at the same time,the fermentation temperature was 30 ℃ and the cellulase activity was 85.73 U/mL. Based on the degradation rate of crude cellulose,the highest degradation rate was the combination ofLongibrachiatumRifai,PenicilliumandCandidautilis,the inoculation amount of mixed bacteria was 10%,and the degradation rate of cellulose reached 38.89% when the yeast was inoculated on the first day and fermented at 30 ℃ for 4 days.After the solid-state fermentation of mixed bacteria,the nutritional value of crops were improved and can be used as a high-quality feed to feed livestock. This will play a positive role in making full use of renewable resources and improving rural environmental pollution.

straw;mixed fermentation;cellulose;solid state fermentation

2016-10-28

任勰珂(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：15985156558@163.com。

*通讯作者:陈莉(1981-)，女，硕士，副教授，研究方向：微生物，E-mail：chen_ccll@126.com。

贵州省科学技术基金([2009]2088)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0130-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.017