徐传标,霍冬雪,胡淇淞,李从发,张家超

(海南大学食品学院,海南海口 570228)

海南发酵食品鱼茶中乳杆菌发酵特性的研究

徐传标,霍冬雪,胡淇淞,李从发,张家超*

(海南大学食品学院,海南海口 570228)

在前期研究中,从海南省传统发酵食品鱼茶中分离获得144株乳杆菌,主要隶属于植物乳杆菌、戊糖片球菌、香肠乳杆菌、短乳杆菌、棒状乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及干酪乳杆菌等。本文从发酵应用的角度出发,对分离得到的乳杆菌进行了一系列的鱼肉发酵特性实验,包括pH变化率实验,耐食盐、耐亚硝盐实验、氨基酸脱羧酶实验等。实验结果表明:R19-5,M1-4,R21-3,R21-4和RD-1五株菌具有快速产酸能力,经过12～16 h发酵后,pH分别能达到3.75、3.89、3.86、3.73和3.74,同时都能耐受150 mg/kg NaNO2溶液和8%盐浓度;菌株在发酵时都不产氨基酸脱羧酶。综合实验结果,筛选出具有优良发酵特性的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)3株,香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)1株和短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)1株。本研究将对寻找优良的肉制品发酵剂和合理利用新的生物资源具有一定的理论指导作用。

鱼茶,乳杆菌,发酵性能

海南鱼茶是我国海南黎族和苗族的一种传统淡水全鱼发酵制品,产品具有回甜咸鲜、香气独特、回味醇厚、保质期长等特点,其是一种高蛋白、低脂肪、富含多种游离氨基酸的风味食品。本课题组对鱼茶制品进行了菌相分析，分离出制品中乳酸菌同时对可培养部分的菌进行分离纯化后测序鉴定出其种属关系。其中乳酸菌包括植物乳杆菌、戊糖片球菌、香肠乳杆菌、短乳杆菌、棒状乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及干酪乳杆菌等144株[1]。

在热带或亚热带地区,人们为了在高温、高湿度条件下保存鱼肉,采用发酵的方式加工传统发酵鱼制品。发酵鱼制品具有浓郁的发酵风味,还具有独特的保健作用,深受当地人民的喜爱。国内外学者对发酵鱼制品进行研究,其中东南亚地区的Nampla、Bakasang[2-3]等传统发酵鱼制品进行了菌相分析和优势菌种的筛选,发现乳酸菌为重要的优势菌群,且与产品品质有着密切的关联性。乳酸菌产生的细菌素能抑制或杀死食源性致病菌,应用生物发酵方法来保持和改善肉类制品的品质或抑制腐败菌的生长是一种很好的食品加工保藏方法[4],同时乳酸菌还有重要的益生功效,如抗癌、降胆固醇、抗氧化、抑菌抗病等[5-8]。但海南鱼茶发酵制品自然发酵方法进行手工作坊式生产,存在着发酵时间长、产品质量稳定性差、安全性低等问题。在自然发酵的情况下存在着其他杂菌生长代谢影响产品的安全性及稳定,并且不同型乳酸菌代谢也会极大的影响产品的风味。发酵剂的选择对发酵制品后期成品的组织结构,安全,风味等特性起关键性作用。

表2 海南鱼茶中分离出的乳酸菌的耐盐实验Table 2 Salt tolerance test of lactic acid bacteria isolated from Hainan Yucha

注:1:分离的菌株数2:实验存活百分含量(%)，是指占该类菌株的百分含量。表3、表4同。本课题组对鱼茶制品菌相分析,发现乳酸菌是重要的优势菌,而迄今为止,对海南鱼茶制品中乳酸菌的菌种特性尚无相关报道。本研究也是首次对海南传统发酵鱼茶制品中存在的乳酸菌菌株特性的考查,对改进我国鱼发酵制品传统发酵工艺、实现其工业化生产具有理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

于鱼茶制品中分离出的144株乳杆菌(已完成分离鉴定见表1)。

表1 鱼茶中微生物分离鉴定结果Table 1 Results of isolation and identification of microorganisms in Yucha

蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、琼脂、酵母膏、溴甲酚紫、精氨酸、半胱氨酸等 BR 级;胆盐、NaCl、柠檬酸二铵、KH2PO4、NaOH、HCl、NaNO2等试剂 AR 级;MRS 培养基 广东环凯微生物科技有限公司。

PB303-N型电子精密天平 梅特勒-托利多仪;RE-5203AA型立式旋转蒸发仪 上海亚荣仪器设备有限公司;YXQ SG41.280型高压蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂;CSY-2型超净工作台 上海净化设备厂;TD5M型台式低速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的生长性能及pH变化率 采取Ammor等人[9]的方法并做修改。将分离得到的不同乳酸菌株接种到MRS 液体培养基中培养,同时以未接种的MRS 液体培养基作空白对照,37 ℃培养0 h开始每隔2 h后分别测定其pH。

1.2.2 耐盐性实验、耐亚硝盐测定 采用胡永金等人[10]和赵亚娟等人[11]方法并做修改。将活化后待测乳酸菌株以1%(v/v)接种至含有2%、4%、8%、10%的NaCl浓度,0、50、100、150 mg/kg的NaNO2浓度液体MRS 培养基中,分别在37 ℃厌氧培养36 h和24 h,同时做空白对照,于λ=600 nm 处测定其OD 值。

1.2.3 氨基酸脱羧酶实验方法 采用Ammor等人[9]的并做修改。将活化后的待测菌株分别按1%(v/v)接入添加有1%(m/v)组氨酸、酪氨酸、赖氨酸及鸟氨酸的含0.06%溴甲酚紫作为指示剂的MRS 培养液中,37 ℃厌氧培养7 d后观察培养液颜色变化,颜色由黄变紫表示菌株氨基酸脱羧酶活性阳性。

1.2.4 数据处理与统计分析 所得数据为三次测定值的平均值,通过Excel 2010 进行数据处理,用origin作图。

2 结果与分析

2.1 耐盐、耐亚硝酸盐测定

根据比浊法原理,以菌株在MRS 液体培养基OD 值的变化,作为微生物生长指标,研究菌株的耐盐和耐亚硝酸盐特性。实验结果如表2所示。

由表2可得出,筛出的菌株均能耐受4%盐浓度,8%盐浓度下对一些菌有抑制作用但是其中13.4%乳杆菌,5.6%戊糖乳杆菌,4.2%香肠乳杆菌能耐受8%盐浓度,所测试菌株均不能耐受10%盐浓度。经过耐盐初筛出的42株乳酸菌进行耐盐硝酸实验,结果见表3,筛选出的菌株在150 mg/kg浓度下的硝酸盐环境下生长正常,均未出现对其产生抑制作用。

表3 海南鱼茶中分离出的乳酸菌的耐亚硝酸盐实验Table 3 Nitrite tolerance test of lactic acid bacteria isolated from Hainan Yucha

表4 氨基酸脱羧酶实验结果Table 4 Test results of amino acid decarboxylase

注:“-”表示实验结果为阴性。2.2 乳酸菌的生长性能及pH变化率

2.2.1 乳酸菌生长曲线 由图1,乳酸菌R19-5,M1-4,R21-3,R21-4,RD-1等五株菌在2 h后进入生长对数期,12～14 h 后达到生长稳定期,而其他乳酸菌进入对数期的时间较上述五株菌稍有延后,但其进入稳定期时间相一致。

图1 生长曲线Fig.1 Growth curve

2.2.2 pH变化率 乳酸菌生长过程的pH变化率见图2,6株植物乳杆菌和其他6株菌显示了较快的pH变化率,在37 ℃,14 h和16 h 内分别使pH迅速降至4.0以下。pH变化表明,乳酸菌R19-5,M1-4,R21-3,R21-4,RD-1均能快速形成乳酸,12 h后pH由起始的pH5.87降至pH3.8左右,而后趋于缓慢下降,在20 h后pH分别能达到3.75、3.89、3.86、3.73、3.74。

图2 pH变化Fig.2 pH change of the samples

2.3 氨基酸脱羧酶实验

经过耐盐筛选后,对42株菌进行氨基酸脱羧酶实验,通过表4可确定其中所有菌株均未有产氨基酸脱羧酶的阳性反应。

3 讨论与结论

乳酸菌的生长性能和产酸能力在发酵过程中起着重要的作用,接入基质中后在经历尽可能短的停滞期后,乳酸菌应能够迅速增殖,快速积累乳酸,以减少致病菌和腐败菌生长导致的危害[15]。快速的产酸能够有效抑制致病菌的生长、加速产品风味的形成、促进产品色泽形成等作用。RingoE[16]等人研究了9株乳酸菌对鱼源致病菌抗菌活性研究发现,其所产的乳酸等酸能抑制病原菌的生长。所测试的菌株具备快速产酸能力,其中由生长曲线图发现12株菌进入稳定期后曲线很快下降的原因可能是在三角瓶中发酵受限于容积和营养物质的消耗。测试菌株在12～16 h能达到稳定期而文献中大多是16～22 h才能达到,这可能是乳酸菌在培养时与其设置的温度相关,文献中采用多采用30 ℃,而本次实验选取37 ℃培养从而使其代谢增快而导致的[17],其次可能是菌株的生长特性。

生物胺(biogenic amines,Bas)是一类含氮的脂肪族、芳香族或杂环类有机化合物的总称。国外学者研究认为BAs在发酵肉制品中普遍存在,特别是在发酵香肠中发酵食品中的BAs主要是由于游离氨基酸被微生物产生的脱羧酶脱羧形成[18-19]。发酵肉制品中的部分乳酸菌具有氨基酸脱羧酶活性,尤其在低pH和高水分含量的条件下,它们往往脱羧某些特定的氨基酸,生成酪胺、组胺、尸胺、腐胺及苯基乙胺。这些化合物不仅会影响发酵食品的风味而且其会对人健康产生危害。因而,研究海南传统鱼茶制品中的乳酸菌是否具有氨基酸脱羧酶活性,对了解鱼茶制品的安全品质及产品是否具备推广价值具有十分重要的意义。

优良的肉制品发酵剂具有安全性,耐6%盐,耐亚硝酸,在15～40 ℃下生长,快速产酸抑菌等特性[18]。本文研究拟在海南的传统鱼茶制品中分离出乳酸菌并对分离出的乳酸菌进行筛选,以期筛选出具有潜在优良商业价值的肉制品发酵剂。本文在海南鱼茶制品中共分离出144株乳酸菌基础上,分别对各菌株进行生理生化、pH变化率、耐盐及亚硝酸盐、氨基酸脱羧酶及生长曲线的菌株特性研究。实验发现3株植物乳杆菌(R19-5,M1-4,R21-3),1株香肠乳杆菌(R21-4)和1株短乳杆菌(RD-1)具有产酸速率快、高耐盐、无氨基酸脱羧酶活性等特性,并发现其具有开发成淡水鱼发酵制品发酵剂的潜力。

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Fermentation characteristics ofLactobacillusisolated in Hainan fermented food Yucha

XU Chuan-biao,HUO Dong-xue,HU Qi-song,LI Cong-fa,ZHANG Jia-chao*

(College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China)

In previous study,a total of 144 strains ofLactobacilluswere isolated from Yucha,a traditional fermented food of Hainan province. After identification,these strains mainly belonged to theLactobacillusplantarum,Lactobacilluspentosus,Lactobacillusfarciminis,Lactobacillusbrevis,Lactobacilluscasei,LactobacilluscoryniformisandLactobacillusrhamnosus. From the perspective of fermentation application,we had made a series ofLactobacillusfermentation characteristic test,including acidification rate test,resistance to salt and the nitrate test,amino acid decarboxylase test. Experimental results showed that:R19-5,M1-4,R21-3,RD-1and R21-4 had fast capacity of acid,after 12～14 h after fermentation,pH can reach 3.75,3.89,3.86,3.89 and 3.86,both tolerated concentration of 150 mg/kg NaNO2and 8% NaCl. Strains in the fermentation did not produce amino acid decarboxylase. The results showed that 3Lactobacillusplantarumstrains,1Lactobacillusfarciminisstrain and 1Lactobacillusbreviswith excellent fermentation characteristics were selected based on the comprehensive test. This research had certain theoretical guidance for looking for excellent meat starter cultures and rational utilization of biological resources.

Yucha;Lactobacillus;fermentation;performance

2016-10-24

徐传标(1990-),男,硕士研究生,研究方向:食品微生物,E-mail:myyou163@163.com。

*通讯作者:张家超(1986-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物,E-mail:zhjch321123@163.com。

海南省高等学校科学研究项目(Hnky2016-12);海南大学科研启动基金(KYQD1548)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0117-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.004