刘 涛， 宋 敏 △， 巩彦龙， 周灵通， 董万涛， 刘建鸿

(1甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000； 2甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020)

活血定眩胶囊含药血清减轻小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3缺氧损伤*

刘 涛1， 宋 敏1△， 巩彦龙1， 周灵通1， 董万涛2， 刘建鸿1

(1甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020)

目的： 研究活血定眩胶囊含药血清对抗缺氧所致小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3损伤的作用。方法：将30只大鼠随机分为空白对照组15只和活血定眩胶囊组15只，采集2组大鼠血清。将bEnd.3细胞分为正常组、缺氧模型组和活血定眩胶囊血清组，给药后，bEnd.3细胞缺氧6 h。显微镜下观察细胞形态，流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期，按试剂盒方法检测细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。结果：活血定眩胶囊含药血清可显著对抗缺氧造成的损伤，明显改善bEnd.3细胞的形态，使缺氧所致细胞凋亡数明显减少，有效抑制缺氧诱导的bEnd.3细胞发生G1/S 期阻滞，抑制MDA生成，增强SOD活性。结论：活血定眩胶囊对缺氧所致bEnd.3细胞的损伤具有明显的对抗作用，其机制与增强细胞抗氧化能力、抑制细胞凋亡有关。

活血定眩胶囊； 小鼠脑微血管内皮细胞； 缺氧； 细胞凋亡

椎动脉型颈椎病(cervical spondylosis of vertebral artery type，CSA)是由于颈椎局部退行性变引起钩小关节位移、椎关节骨质增生、颈部肌肉痉挛等刺激压迫椎动脉，引发椎动脉狭窄、痉挛或屈曲等改变，从而导致椎基底动脉供血不足引起眩晕、眼花、耳鸣、头项僵痛甚则昏厥为主要临床表现的一种颈椎病，临床发病率仅次于神经根型颈椎病，约占所有颈椎病的20%。近年来，该病呈现出不断增长和年轻化趋势[1-2]。血管内皮细胞具有维持管壁通透性、抗血栓形成、调节血管张力、血压和血流速度的生理功能，干预多种与血管有关疾病的生理病理过程[3]。bEnd.3细胞是人工改造而获得的一种血管内皮细胞株，具备一系列微血管内皮细胞的特征。活血定眩胶囊是甘肃中医药大学附属医院院内制剂，经过十几年临床应用与实验研究，对CSA疗效确切，但其机理尚未明了。前期体外研究表明，活血定眩胶囊能改善血管微循环、抑制自由基的氧化损伤，对大鼠椎动脉血流动力学及血液流变学改变方面具有良好的改善作用[4-5]。本实验采用小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3建立缺氧损伤模型，从细胞水平上探讨活血定眩胶囊对缺氧所致bEnd.3细胞损伤的作用及其机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 药品与试剂 活血定眩胶囊的组成包括炙黄芪、丹参、粉葛、白芷等，每粒0.5 g，甘肃中医药大学附属医院配制生产，批准文号为甘药制字Z20130010；胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液(Gibco)；丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和PI/RNase staining缓冲液(BD)；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 动物及细胞株 10月龄SPF级健康Wistar大鼠 30只，雌雄各半，体质量(300±20) g，生产许可证号为SCXK(甘)2015-0021，由甘肃中医药大学实验动物中心提供。小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3为和元生物技术有限公司提供。

1.3 仪器 全自动细胞荧光计数分析仪(Cellometer)；流式细胞仪(COULTER EPICS XL)；酶标仪(Bio-Rad)；倒置相差显微镜(Olympus)；二氧化碳培养箱(日本三洋电机公司)。

2 方法

2.1 含药物血清的制备 将30只SPF级Wistar大鼠(雌雄各半)随机分为空白对照组和活血定眩胶囊组。依据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算Wistar大鼠灌胃剂量，以5倍等效剂量的活血定眩胶囊给大鼠灌服，空白对照组只灌服相同体积的生理盐水。每日 2 次，连续给药 7 d，末次灌胃2 h后用10% 水合氯醛麻醉，腹主动脉采集血液，3 000 r/min离心15 min，过滤除菌后制得含药血清，-20℃保存。

2.2 bEnd.3细胞的培养 复苏小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3，将其用含10%胎牛血清的DMEM培养基转移至细胞培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱中继续传代培养，待细胞生长至融合状态后用0.5% 胰蛋白酶消化传代备用。

2.3 分组、给药与造模 经MTT实验确定活血定眩胶囊细胞毒性剂量范围，预实验确定给药剂量。取长成致密单层的bEnd.3细胞，分为正常组、模型组和活血定眩胶囊含药血清组，每组5个复孔。给药前轻轻吸去6孔板里培养基，PBS洗1 遍，正常组和模型组加入10%空白血清+无血清DMEM培养基，给药组加入无血清DMEM完全培养基+10%活血定眩胶囊含药血清。正常组37 ℃、5% CO2培养箱内静置培养6 h；其它各组均置于37 ℃三气培养箱中，持续通入95% N2+5% CO2的混合气体缺氧6 h[6-7]，倒置显微镜下观察(×40)各组细胞形态。

2.4 MDA含量和SOD活性的检测 实验按“2.3”项方法分组、给药及造模，去除各组细胞培养基，PBS 洗2次，用细胞刮收集培养皿中细胞，在冰上用细胞破碎机破碎细胞，4 ℃、12 000 r/min离心20 min 后取上清，上样量为100 μL，再按试剂盒说明书方法测定MDA和SOD活性。

2.5 流式细胞术检测bEnd.3细胞周期及早期凋亡 实验按“2.3”项方法分组、给药及造模，每组设3个复管，以70%乙醇、-20 ℃ 固定2 h，PBS和PI/RNase staining缓冲液分别洗细胞1 次，PI 染色30 min，流式细胞仪检测。按照上法,每组设3个复管，加Annexin V binding 缓冲液500 μL，振荡成单细胞悬液，Annexin V-FITC/PI 双染后，流式细胞仪检测。

3 统计学处理

数据用SPSS 19.0 统计软件进行处理，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间均数的两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 bEnd.3 生长曲线的测定

使用MTT测定第3代小鼠bEnd.3细胞1～8 d的活力，绘制的生长曲线呈S型，由图1可见细胞在前2 d生长缓慢，第3天起迅速增长，6 d后生长减慢。由此选择传代后3～5 d进行共培养实验。

2 形态学观察

倒置显微镜观察各组细胞。正常组bEnd.3细胞多呈长梭形或多边形，排列紧密，呈典型“铺路石”样排列; 模型组细胞体积收缩，细胞间间隙扩大，且出现很多亮点，出现越来越多的凋亡及坏死细胞；活血定眩胶囊含药血清组相较于模型组而言，细胞连接更紧密，形态更饱满，说明活血定眩胶囊含药血清能减轻在缺氧条件下小鼠脑微血管内皮细胞的细胞形态，见图2。

Figure 1.The growth curve of the third generation of bEnd.3 cells cultured with 10% FBS.

Figure 2.Morphological observation of bEnd.3 cells in each group(×40).

3 活血定眩胶囊对缺氧损伤的bEnd.3细胞中MDA含量与SOD 活性的影响

与正常组相比，模型组bEnd.3细胞由于缺氧促进MDA的释放，SOD活性降低(P<0.01)，表明细胞膜受到了明显损伤，通透性增加，清除氧自由基的能力下降。活血定眩胶囊含药血清组能显著抑制细胞上清液中MDA的增加(P<0.01)，并显著增强SOD 的活性(P<0.01)，见表1。

表1 活血定眩胶囊对缺氧损伤的bEnd.3细胞MDA含量和SOD活性的影响

**P<0.01vsnormal group；△△P<0.01vsmodel group.

4 活血定眩胶囊对缺氧损伤的bEnd.3细胞早期凋亡的影响

正常组早期凋亡bEnd.3细胞仅有6.5%；缺氧模型组则高达45.5%；活血定眩胶囊含药血清作用于bEnd.3细胞6 h后，早期凋亡率为17.5%，与模型组相比差异显著(P<0.01),表明活血定眩胶囊能够明显抑制缺氧诱导的bEnd.3细胞早期凋亡的进程，见图3、表2。

Figure 3.Effects of Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum on early apoptosis of bEnd.3 cells induced by hyoxia.

5 活血定眩胶囊对bEnd.3细胞周期的影响

与正常组比较，模型组G1期bEnd.3细胞显著增加(P<0.05)，S期细胞显著减少(P<0.01)，表明缺氧可诱导bEnd.3细胞发生G1/S 期阻滞。与模型组相比，活血定眩胶囊含药血清组S期细胞显著增加(P<0.05)，G1期细胞减少(P<0.05)，表明活血定眩胶囊含药血清能有效抑制缺氧诱导的bEnd.3细胞发生G1/S期阻滞，见图4、表2。

Figure 4.Effects of Huoxue-Dingxuan capsule on the cell cycle of bEnd.3 cells induced by hypoxia.

表2 活血定眩胶囊对缺氧损伤的bEnd.3早期凋亡率及细胞周期的影响

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

讨 论

CSA是颈椎病的常见类型之一,由于病因复杂，发病机制尚未完全明了，其预防与治疗比较棘手。目前多认为CSA是由于颈椎退行性改变、椎基底动脉供血不足、组织慢性缺血缺氧损伤，从而出现以眩晕为主的临床综合征[8]。CSA发病过程中，由于颈椎退行性变引起钩椎关节骨质增生、小关节位移、颈部肌痉挛、颈交感神经等因素刺激，椎动脉血管炎症反应，释放有关细胞因子、内分泌激素、神经递质和神经肽类等信息分子，导致椎-基底动脉供血不足，以致出现慢性脑缺血缺氧损伤。减轻缺血缺氧后内皮损伤是防治椎动脉型颈椎病疾病的重要手段，也是中药治疗CSA的作用靶点[9]。

活血定眩胶囊作为甘肃中医药大学附属医院院内制剂，由宋敏教授根据多年临床经验研制，已在临床应用多年，其主要成分包括炙黄芪、菊花、天麻、桑寄生、钩藤、丹参、葛根、鸡血藤、甘草等，具有活血、定眩、通络、补益等功效。在不同药物剂量组的CSA大鼠研究中发现，该药能有效改善CSA大鼠的血液流变学指标。其中君药为黄芪，具有补气、祛瘀散结之效,可有效抑制血小板聚集，改善血流变学、扩张血管等功效[10]。鸡血藤、丹参和葛根为臣药，具有活血、化瘀、通络之功效，能有效改善微循环，扩张血管，抗动脉粥样硬化，抗脑缺血，保护心肌，抗血栓，抗氧化等功能[11-12]。佐以钩藤、天麻、菊花和桑寄生,定眩明目，熄风止痉，补肝益肾。其中天麻的主要有效成分天麻素可改善血管的扩张功能，提高脑组织5-羟色胺水平[13]。钩藤中含有多种吲哚类生物碱，具有镇静、降压、抗惊厥、钙拮抗剂的作用，并可以抗血栓，调节多巴胺、去甲肾上腺素等神经元功能[14]。甘草作为使药，起调和诸药之功能。诸药合用，共奏活血化瘀、定眩止痛、通络补益之功。

椎动脉缺血缺氧时，能量代谢障碍，导致大量Na+内流，K+外流，细胞膜电位下降，产生去极化，引发大量Ca+内流引起脑细胞损伤，血脑屏障破坏，产生大量氧自由基可使生物膜中的多不饱和脂肪酸发生过氧化反应，引起细胞损伤，诱导细胞凋亡。MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物,对MDA的检测可反映出机体内脂质过氧化和机体细胞受自由基攻击的损伤程度[15]。SOD是体内重要的抗氧化酶，当体内自由基生成增多时，它与超氧阴离子反应生成过氧化氢，再由过氧化氢酶和谷胱甘肽酶转变成水，从而使自由基清除，保护细胞免受损伤[16]。本实验结果表明，活血定眩胶囊对缺氧损伤的bEnd.3细胞具有保护作用，能明显抑制细胞上清液中MDA含量的增加，保护细胞膜的稳定性，显著增强细胞内SOD的活性，改善能量代谢，有效抑制缺氧诱导的bEnd.3发生G1/S 期阻滞和早期凋亡，且使受损细胞形态得到明显改善。

综上所述，活血定眩胶囊对缺氧损伤的bEnd.3细胞具有显著的保护作用，其机制可能与抑制细胞凋亡、减少氧自由基生成、提高细胞对氧自由基的清除能力有关。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Protective effect of Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum on mouse brain microvascular endothelial cell line bEnd.3 with hypoxic injury

LIU Tao1, SONG Min1, GONG Yan-long1, ZHOU Ling-tong1, DONG Wan-tao2, LIU Jian-hong1

(1GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China;2AffiliatedHospitalofGansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730020,China.E-mail:sm@gszy.edu.cn)

AIM: To investigate the protective effect of Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum on mouse brain microvascular endothelial cell line bEnd.3 with hypoxic injury. METHODS: The Wistar rats were randomly divided into control group and Huoxue-Dingxuan capsule group. The serum was collected at the 7th day after drug administration. The bEnd.3 cells were divided into normal group, hypoxia serum model group and Huoxue-Dingxuan capsule serum group. After administration of the medicated serum, bEnd.3 cell were treated with hypoxia for 6 h. The cell morphology was observed under microscope, the apoptosis rate and cell cycle were detected by flow cytometry, and the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were detected by ELISA. RESULTS: Compared with other groups, Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum significantly resisted the injury caused by hypoxia, obviously improved the morphology of bEnd.3 cells, significantly reduced the number of apoptotic cells induced by hypoxia, and effectively inhibited the occurrence of hypoxia-induced G1/S phase arrest in the bEnd.3 cells. At the same time, the medicated serum inhibited MDA production, and increased SOD activity. CONCLUSION: Huoxue-Dingxuan capsule attenuates hypoxia-induced bEnd.3 cell damage by enhancing the antioxidant capacity of cells and inhibiting cell apoptosis.

Huoxue-Dingxuan capsule; Mouse brain microvascular endothelial cells; Hypoxia; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0552- 05

2016- 08- 11

2016- 11- 14

国家自然科学基金资助项目(No. 81360554)；甘肃省自然科学基金资助项目(No. 1506RJZA048)；甘肃省财政厅基本科研业务课题(No. BH2010-428)； 甘肃省中药现代制造工程研究院项目(No. YWW-2015049)

△通讯作者 Tel: 0931-8765377; E-mail： sm@gszy.edu.cn

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.029