王学惠， 刘慧兵， 赵国安

(新乡医学院第一附属医院心血管内科，河南 卫辉 453100)

神经调节蛋白1β联合卡托普利对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响*

王学惠， 刘慧兵， 赵国安△

(新乡医学院第一附属医院心血管内科，河南 卫辉 453100)

目的： 探讨神经调节蛋白1β(neuregulin-1, NRG-1β)与卡托普利单用及联合应用对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响。方法：将青年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、心衰组、NRG-1β干预组、卡托普利干预组和联合用药组。采用腹主动脉-腔静脉穿刺造瘘法制备心衰模型。通过血流动力学和血浆BNP水平评价大鼠心功能，TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数；Western blot检测各组大鼠左心室心肌p-Akt、Bax和Bcl-2的蛋白水平。结果：与心衰组比较，NRG-1β组、卡托普利组及联合用药组左心室舒张末压、心肌凋亡指数明显降低，±dp/dtmax明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；Bax 蛋白表达明显降低，p-Akt和Bcl-2蛋白水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。而与NRG-1β组和卡托普利组相比，联合用药组效果更加显著(P<0.05)。结论：神经调节蛋白1β与卡托普利单用及联合应用均可有效改善心功能、抑制心肌细胞凋亡，联合用药的疗效优于单独用药。

神经调节蛋白1β； 卡托普利； 心力衰竭； 细胞凋亡

心力衰竭(heart failure, HF)是由于心功能明显受损导致的临床综合征，是多种心血管疾病的共同转归，预后差，被称为心脏的恶性肿瘤，5年的生存率不足50%[1]。神经调节蛋白 1(neuregulin-1，NRG-1)是血管内皮来源的生长因子，在心脏由心内膜和心脏微血管内皮细胞合成和分泌，与其受体ErbB在细胞中形成NRG-1/ErbB信号系统，调控心脏的胚胎发育、生长调控，并与心脏肥大、心衰发生乃至预后密切相关[2]。据报道，外源性NRG-1激活NRG-1/ErbB信号系统治疗心衰能明显改善心衰模型动物及心衰患者的心功能，是近年来新的有前途的药物[3-6]。卡托普利(captopril，CAP)作为血管紧张素转化酶抑制剂治疗心衰已得到大量循证医学的证据，它能抑制左室重构、改善心功能，明显改善心衰患者预后，其中很重要机制之一是通过抑制细胞的凋亡[7]。NRG-1联合卡托普利治疗心衰是否能加强抗心衰的效应进一步改善预后及其机制，目前不明。本研究以容量超负荷心衰大鼠为模型，通过外源性给予NRG-1β及卡托普利在体干预，观察两者对大鼠心功能及心肌细胞凋亡的影响，探讨两者联合治疗的作用及机制。

材 料 和 方 法

1 材料

NRG-1β购于Prospec-Tany TechnoGene；TUNEL检测试剂盒购于Roche；卡托普利由Bristol-Myers Squibb惠赠；脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)ELISA检测试剂盒购于Assay Pro；抗p-Akt单克隆抗体、抗Bcl-2 和Bax鼠单抗以及辣根酶标记山羊抗鼠IgG购于Santa Cruz。BL-420生物机能系统购于成都泰盟生物技术有限公司。

2 实验动物及分组

普通青年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重160～180 g，由西安交通大学实验动物中心提供，均予正常饮食、自由饮水。90只实验动物随机分成5组，假手术组(sham组)10只、HF组20只、NRG-1β组20只、CAP组20只、联合用药组(NRG-1β+CAP组)20只。HF组、NRG-1β组、CAP组、联合用药组均采用主动脉-腔静脉穿刺造瘘手术(aortocasval fistula，ACF)法制备容量超负荷心衰模型，sham组只穿刺不造瘘。NRG-1β组ACF术后8周，大鼠尾静脉注射NRG-1β(10 μg·kg-1·d-1)，连续7 d, 之后继续饲养至12周；CAP组ACF术后第2天开始给予卡托普利灌胃(13.5 mg·kg-1·d-1)，8周后经大鼠尾静脉注射同等量的生理盐水，连续7 d，之后继续饲养至12周；联合用药组ACF术后第2天开始给予卡托普利灌胃(13.5mg·kg-1·d-1)，8周后经大鼠尾静脉注射NRG-1β(10 μg·kg-1·d-1)，连续7 d, 之后继续饲养至12周。

3 方法

3.1 容量超负荷心衰动物模型的建立 水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射麻醉。腹部正中切口，打开腹腔，暴露下腔静脉和腹主动脉。先在距左、右髂动脉分支上方3 mm处腹动脉前壁上做U形缝合，夹闭腹主动脉，持18G留置针头在缝合口处沿前壁向上刺入腹主动脉，继续向上、向右行至腹腔动-静脉联合壁，并刺破进入下腔静脉，拔出穿刺针，收紧U形缝合口缝线并打结，缝合腹壁。假手术组穿刺腹主动脉后不进入下腔静脉造瘘，其余步骤与手术组相同。

3.2 血流动力学的测定 麻醉同前，分离右侧颈动脉，插管，导管通过压力传感器与泰盟BL-420F多导生理监护仪连接，待波形稳定后继续逆行插入左心室，记录左室收缩末压(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室内压最大上升、下降速率(±dp/dtmax)等指标。

3.3 心脏重量的测定 麻醉后立即开胸取出心脏，在预冷的0 ℃～4 ℃生理盐水中洗去淤血，滤纸吸干水分，应用精密天平测定各组动物的心脏湿重，计算心重比。

3.4 血浆BNP的测定 麻醉后，从大鼠的腹主动脉抽出血液约2 mL，EDTA-K2抗凝，常温静置30～60 min后，以3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用BNP ELISA检测试剂盒，按说明书操作。

3.5 心肌细胞凋亡率的检测 左室心肌组织常规行石蜡包埋，切片，片厚4 μm，采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)标记大鼠左心室肌凋亡细胞核中的DNA3’-OH末端，DAB显色。凋亡心肌细胞TUNEL阳性表现为胞核呈深棕黄色，心肌细胞轮廓完整。心肌细胞凋亡指数(apoptotic index, AI)的测定：每组动物5张切片，每张切片取5个高倍视野计数凋亡细胞核数，计算凋亡细胞核数/总细胞核数，取其平均值为细胞凋亡指数。

3.6 p-Akt、Bax和Bcl-2蛋白的定量检测 取米粒大小的左室心肌组织在冰上研磨、裂解后用酶标仪测蛋白浓度，根据所测得蛋白浓度上样总蛋白质量为50 μg，经SDS-PAGE分离后，采用电印迹转移法将蛋白质转至PVDF膜，丽春红S染色，用质量浓度为5%的脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h后，分别加入抗p-Akt单克隆抗体、抗Bax、Bcl-2和GAPDH 抗体，4 ℃孵育过夜，室温下TBST溶液洗膜后加入兔(鼠)Ⅱ抗孵育2 h，用TBST溶液洗膜后与ECL试剂反应，胶片曝光，扫描胶片，用UVlDOC软件进行条带灰度分析，以p-Akt、Bax、Bcl-2与GAPDH条带的积分吸光度(IA)比值来评定的3种蛋白质的表达水平。

4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件统计分析, 计量数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 血流动力学指标的比较

同sham组相比，HF组大鼠LVESP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均明显减低(P<0.05)，LVEDP显著升高(P<0.05)，提示HF组大鼠的收缩及舒张功能均明显下降。NRG-1β治疗后，大鼠LVESP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均较HF组明显升高(P<0.05)，LVEDP显著降低(P<0.05)，提示NRG-1β能明显改善心衰大鼠的心功能。CAP治疗后CAP组取得与NRG-1β组相似的治疗效果。联合用药后，NRG-1β+CAP组与NRG-1β组、CAP组相比，LVESP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高(P<0.05)，LVEDP显著降低(P<0.05)，提示心功能进一步改善。而NRG-1β组与CAP组相比差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1.The hemodynamic indexes in various groups. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs HF group; $P<0.05 vs NRG-1β group; &P<0.05 vs CAP group.

2 各组大鼠心重/体重比的比较

与sham组相比，HF组大鼠的心重/体重比明显增加(P<0.05)，提示ACF可通过容量超负荷引起心肌肥大。而NRG-1β或CAP治疗后，心重/体重比与HF组比较，差异没有统计学意义，但有降低的趋势，提示NRG-1β或CAP在一定程度上能抑制左室肥大。NRG-1β+CAP组与HF组相比，心重/体重比明显降低(P<0.05)，与NRG-1β组、CAP组相比差异显著(P<0.05)，提示两者联合应用逆转左室肥大效果显著，优于单一用药，见表1。

3 各组大鼠血浆BNP的比较

与sham组相比，HF组大鼠的血浆BNP水平明显升高(P<0.05)；而NRG-1β或CAP单独治疗后，血浆BNP水平明显降低(P<0.05)。联合用药后，NRG-1β+CAP组与NRG-1β组、CAP组相比，血浆BNP水平明显降低，而NRG组与CAP组相比差异无统计学显著性，见表2。

表1 各组大鼠心重/体重比的比较

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group;$P<0.05vsNRG-1β group;&P<0.05vsCAP group.

4 各组大鼠心肌细胞凋亡染色及AI的比较

显微镜下观察TUNEL染色切片，凋亡心肌细胞TUNEL阳性表现为胞核呈深棕黄色，心肌细胞轮廓完整。Sham组心肌偶可见散在 TUNEL阳性细胞, HF组与NRG-1β治疗组均出现TUNEL阳性细胞, NRG-1β治疗组的AI显著低于HF组(P<0.05)，CAP组取得与NRG组相似的治疗效果(P<0.05)。联合用药后，NRG-1β+CAP组与NRG-1β组、CAP组相比，AI进一步降低(P<0.05)，见图2、表2。

表2 各组大鼠血浆BNP及凋亡指数的比较

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group;$P<0.05vsNRG-1β group;&P<0.05vsCAP group.

Figure 2. TUNEL staining of the left ventriclein various groups (×400).

5 各组大鼠左室心肌组织 p-Akt、Bax和Bcl-2含量的比较

同sham组相比，HF组大鼠左室心肌组织的p-Akt和Bcl-2水平均明显减低(P<0.05)，Bax显著升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax明显降低。NRG-1β治疗后，NRG-1β组大鼠与HF组相比，p-Akt、Bcl-2和Bcl-2/Bax均明显升高(P<0.05)，而Bax显著降低(P<0.05)，提示NRG-1β对凋亡相关基因的表达有显著的影响。CAP治疗后的治疗效果与NRG-1β组相似。联合用药后，NRG-1β+CAP组与NRG-1β组、CAP组相比，p-Akt、Bcl-2和Bcl-2/Bax均明显升高(P<0.05)，Bax显著降低(P<0.05)，提示联合用药组对凋亡相关基因的表达比单一干预组NRG-1β组或CAP组影响更大，而NRG-1β组与CAP组相比差异无统计学显著性，见图3。

讨 论

本实验采用ACF法制备容量超负荷大鼠心衰模型，NRG-1β与卡托普利单用及联合用药对心力衰竭大鼠进行干预，与sham组相比，HF组大鼠LVEDP、±dp/dtmax和血浆BNP水平均明显降低，提示ACF法制备心衰模型的成功；HF组大鼠心重/体重比明显增加，证实了ACF术后，大鼠心脏发生了肥大及结构重构；HF组左室心肌TUNEL染色显示存在明显的细胞凋亡。与HF组相比，NRG-1β组、CAP组及NRG-1β+CAP组大鼠LVEDP、±dp/dtmax和血浆BNP水平均明显升高，心功能改善；心重/体重比明显降低，大鼠心脏重构明显逆转；凋亡指数降低，提示明显抑制心肌细胞的凋亡，说明NRG-1β与卡托普利在保护心功能、逆转左室重构、抑制心肌细胞凋亡方面疗效相似；NRG-1β+CAP组分别与NRG-1β组、CAP组相比，效果更加显著，差异具有统计学意义，提示两者具有协同作用，联合应用能进一步抑制心肌细胞凋亡，逆转左室重构效果最佳。

心肌细胞凋亡是心肌损害的重要形式，可引起心肌细胞数量减少，进而引起心肌收缩功能的下降，心力衰竭进行性恶化，心室壁变薄、心腔扩大。PI3K/Akt 信号通路是调节细胞增殖、分化和凋亡的重要转导途径，是细胞存活和抗凋亡的关键性途径。通过 Akt磷酸化，下调促凋亡或诱导抗凋亡的蛋白表达而抑制凋亡。Akt是 PI3K 下游最重要的靶酶，负责传递PI3K 的始动信息[8]。Bcl-2 家族蛋白是在细胞凋亡过程中起重要作用的一类蛋白质，调控细胞凋亡。研究表明，Bcl-2 与Bax 既可形成同二聚体，也可相互作用为二聚体。Bcl-2 和Bax 蛋白水平高低与凋亡调控直接相关；Bax增高，促进细胞凋亡；Bcl-2 增高，抑制细胞凋亡，细胞在受凋亡刺激后的生存能力由Bcl-2 与Bax 的比率决定，高水平的Bcl-2/Bax有助于细胞生存，过低则促进凋亡[9-11]。

Figure 3.Expression of p-Akt, Bax, Bcl-2 and Bcl-2/Bax in the left ventricle of rats in various groups. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs HF group; $P<0.05 vs NRG-1β group; &P<0.05 vs CAP group.

近年来研究表明，NRG-1能促进心肌细胞存活、抗凋亡。Zhao等[12]认为NRG-1与其它促丝裂素不同，其促进新生和成年心肌细胞存活的机制，部分是由于抑制心肌细胞的凋亡。An等[13]报道NRG-1通过激活Akt依赖的途径保护阿霉素诱导的心肌细胞的凋亡。Jie等[14]研究发现NRG-1抑制心肌细胞的凋亡是通过激活PI3K/Akt通路抑制线粒体转换通透孔。Guo等[15]也报道NRG-1β改善心衰大鼠心功能及左室重构，与NRG-1β减轻线粒体的损伤、抗凋亡及抗氧化应激有关。本研究也发现NRG-1能降低Bax表达，增加Bcl-2的表达，增加Bcl-2/Bax的比值。其可能机制是增加p-Akt的表达，激活PI3K/Akt信号通路，调节下游凋亡相关蛋白的表达。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统是人体内重要的体液调节系统，在心力衰竭的发生发展中起重要的调控作用， 心肌组织局部血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ能诱导心肌细胞肥大，促进心肌细胞的凋亡，体外研究也证实AngⅡ能诱导心肌细胞凋亡[16]。卡托普利是血管紧张素转换酶抑制剂，阻断了循环和局部组织中AngⅡ的形成，减轻氧化应激，从而发挥抗凋亡作用[7]。本研究也发现卡托普利能上调p-Akt，激活PI3K通路，降低Bax表达，增加Bcl-2表达，调节Bcl-2/Bax比值，发挥抗凋亡的作用。而且与NRG-1β联合应用，作用叠加，抑制心肌细胞凋亡作用明显加强，心功能得到了进一步的改善，提示对p-Akt表达的影响可能是联合用药优于单一用药抗凋亡作用的分子机制之一。

综上所述，NRG-1β与卡托普利联合用药较单一用药更能有效改善心功能，抑制心肌细胞凋亡，延缓心力衰竭，为临床治疗慢性心力衰竭的联合用药提供了实验依据。NRG-1与卡托普利在治疗心力衰竭、抑制心肌细胞凋亡方面具有协同作用，其详细分子机制十分复杂，有待进一步研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effect of neuregulin-1β combined with captopril on myocardial cell apoptosis and related gene expression in rats with chronic heart failure

WANG Xue-hui, LIU Hui-bing, ZHAO Guo-an

(DepartmentofCardiovascularMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangUniversity,Weihui453100,China.E-mail:wangxuehui000@126.com)

AIM: To study the effect of neuregulin-1 (NRG-1β) or captopril alone and their combination on myocardial cell apoptosis and related gene expression in rats with chronic heart failure. METHODS: Young male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group, heart failure group, NRG-1β group, captopril group and combined treatment group. The volume overloaded heart failure model in the rats was established by aortocaval fistula. The cardiac function was evaluated by determining the changes of hemodynamics and plasma BNP level. The apoptotic index (AI) of myocardial cells was assayed by TUNEL. The protein levels of p-Akt, Bax and Bcl-2 in left ventricular tissue were detected by Western blot. RESULTS: The LVEDP, AI and the expression of Bax were significantly lower in NRG-1β group, captopril group and combined treatment group than those in heart failure group (P<0.05), while the values of ±dp/dtmaxand the protein levels of p-Akt and Bcl-2 were significantly higher in NRG-1β group, captopril group and combined treatment group than those in heart failure group (P<0.05). The effect of combined treatment group was more significant (P<0.05) than that in NRG-1β group and captopril group. CONCLUSION: Neuregulin-1β or captopril alone and the combination of them effectively improve the cardiac function and inhibit myocardial cell apoptosis in chronic heart failure rats. The therapeutic effect of combination of NRG-1β and captopril is better than that of NRG-1β or captopril alone.

Neuregulin-1β; Captopril; Chronic heart failure; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0417- 06

2016- 09- 18

2016- 11- 21

河南省基础与前沿技术研究计划项目(No. 142300410191)；河南省科技攻关计划项目(No. 152102310114)

△通讯作者 Tel: 0373-4403122; E-mail： wangxuehui000@126.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.006