李 琳 晁红梅 裴银辉

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063000

正交设计优化淋病奈瑟菌灭活疫苗免疫条件

李 琳 晁红梅 裴银辉

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063000

①目的 应用正交设计优化淋病奈瑟菌灭活疫苗免疫条件，为淋病奈瑟菌灭活疫苗的应用提供实验依据。②方法 将淋病奈瑟菌稀释为1×109CFU/mL、1×108CFU/mL和1×107CFU/mL 3个浓度备用；选择皮内注射、肌肉注射、皮下注射三种免疫途经，设定初次免疫与第二次免疫的时间间隔依次为2、3、4周；根据L9(34)正交设计表的方案对家兔进行免疫，末次免疫7天后应用玻片凝集试验分别测定各试验组家兔血清中抗体效价。③结果 抗原浓度分别为1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL时血清中抗体效价几何均值分别为4.6357、5.7196、6.0206，浓度为1×109CFU/mL免疫效价最高；采用皮内注射、肌肉注射和皮下注射三种免疫途经的家兔血清中抗体效价几何均值分别为为5.7195、5.4185和5.2379，皮内注射抗体凝集效价高于其他两种方式；免疫间隔2周、3周和4周时血清中抗体效价几何均值分别为5.2379、5.5991和5.5389，其中间隔在3周为最佳。④结论 免疫剂量为1×109CFU/mL、皮内注射、初次与二次免疫间隔在3周为最佳免疫组合。

淋病奈瑟菌 正交设计 免疫条件

[KEY WORS] Neisseria gonorrhoeae.Orthogonal design.Immune condition

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)为淋病(gonorrhea)的病原体。人类是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通过性接触而传播。感染患者主要发生泌尿生殖系统损害，表现为尿道炎和宫颈炎，以及附睾炎、盆腔炎等并发症，女性患者还可由于并发症造成不育、宫外孕等严重后果，研制主动免疫预防和治疗免疫制剂，积极采取包括疫苗研制在内的防治控制措施显得更为迫切。目前淋病奈瑟菌疫苗主要包括淋球菌全细胞疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等几种类型。全细胞疫苗作为传统疫苗，具有保留良好的免疫原性及安全有效的优点。确立全细胞疫苗免疫效果与其注射途径、注射剂量及免疫接种时间的相互关系，是正确应用全细胞疫苗主动免疫淋病的关键[1]。本研究旨在通过正交设计优化免疫条件，为淋病奈瑟菌灭活疫苗的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 CMCC 29403(购自中国食品药品检定所)。

1.1.2 实验动物 健康雄性家兔，体重2.0～2.5kg，华北理工大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 淋病奈瑟菌培养 CMCC 29403标准菌珠接种于血琼脂平板，5%～10% CO2厌氧培养箱中37℃培养48小时,形成直径为1.0～1.5mm无色、透明、圆形光滑菌落；无菌挑取2～3个菌落加入胎牛血清肉汤培养基中培养48小时，60℃恒温水浴箱灭活20分钟，吸取灭活后菌液培养液1mL加入巧克力色血琼脂平板中培养，无菌落生长，证实培养液中淋病奈瑟菌已经完全灭活，血细胞计数板计数，以无菌胎牛血清分别稀释为1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL 3种免疫浓度。

1.2.2 免疫佐剂制备 称取羊毛脂10g加入45mL液体石蜡中加热融化冷却至室温，入研钵中同方向研磨成乳剂后8磅高压灭菌15分钟，放至室温后4℃冰箱冷藏备用。于上述液体中边研磨边逐滴加入卡介苗75mg，加完后继续研磨成乳剂，滴于水上5～10分钟内完全不扩散为合格；8磅高压灭菌15分钟，放置室温后4℃冰箱保存备用。

1.2.3 正交设计免疫方案 选择体质量2.0～2.5kg健康雄性家兔45只，适应性饲养1周后，随机分为9组，每组5只。分别采用灭活疫苗浓度1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL经皮内、皮下及肌肉注射三种注射方式进行免疫，免疫剂量为1mL，初次免疫与第2次免疫时间间隔分别选择第2、3、4周3组时间间隔进行。按L9(34)的免疫程序进行免疫，见表1。

表1 淋病奈瑟菌全细胞疫苗免疫方案正交设计表

1.2.4 免疫血清效价测定 每组家兔末次免疫7天后，抽取耳缘静脉血2mL置于灭菌试管中，室温静置1小时至血液凝固后入4℃冰箱过夜析出血清，凝集试验测定免疫血清效价。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0对数据进行统计学处理，计量资料采用方差分析，检验水准均采用双侧α=0.05。

2 结果

抗原浓度为1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL时血清中抗体效价几何均值分别为4.6357、5.7196和6.0206，浓度为1×109CFU/mL免疫效价最高，与其他两种抗原浓度所产生的免疫效价比较，差异具有统计学意义；皮内注射、肌肉注射和皮下注射给药三种免疫途经血清中抗体效价几何均值分别为为5.7195、5.4185和5.2379，皮内注射抗体效价高于其他两种免疫途径产生的抗体效价，差异具有统计学意义；免疫间隔2周、3周和4周时血清中抗体效价几何均值分别为5.2379、5.5991和5.5389，其中二次免疫间隔在3周为最佳选择，与免疫间隔2周、3周时血清抗体效价几何均值比较，差异具有统计学意义。因此，由正交设计确定的最佳免疫条件组合是：免疫剂量1×109CFU/mL、皮内注射、初次与二次免疫间隔为3周。见表2。

表2 正交实验优化淋病奈瑟菌灭活疫苗免疫条件结果

注：免疫剂量1=1×107CFU/mL,2=1×108CFU/mL,3=1×109CFU/mL;

免疫途径1=皮内,2=皮下,3=肌肉注射;免疫时间间隔1=2周,2=3周,3=4周

3 讨论

淋病为全球发病率较高的性传播疾病之一，人类是淋病奈瑟菌的唯一宿主，经性行为传播，多侵袭泌尿生殖道黏膜，主要引起男性急性尿道炎、前列腺炎、附睾炎等。在女性主要以隐性感染为主，常因不及时治疗而导致盆腔炎、子宫内膜炎,甚至不孕证的发生[2]。近年来，淋病奈瑟菌的耐药性日益增强，淋病的治疗变得越发困难[3]。因此，研制有效的淋球菌疫苗及合理的免疫程序无疑会为淋病的防治提供有效的主动免疫方案。

目前淋病奈瑟菌疫苗的研制已发展为包括全细胞疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗在内的多个种类。淋病奈瑟菌全细胞疫苗属于颗粒性抗原，具有较强的免疫原性，可直接注射动物产生相应的抗血清[4]。机体在抗原物质的刺激下产生特异性免疫反应的过程，大体上可分为3个阶段。①致敏阶段(加工处理抗原阶段)：当颗粒性抗原初次进入人体内时，首先被巨噬细胞吞噬。通过胞浆内溶酶体酶的作用，把抗原物质消化降解，而保留其抗原决定簇(特异性抗原成分)。经过处理的抗原与巨噬细胞的RNA结合成为抗原-RNA复合物，具有强烈吸引免疫活性细胞的作用，能把抗原-RNA复合物传递给免疫活性细胞(Immunologically competent cell),启动免疫反应。②反应阶段(淋巴细胞分化增殖阶段)：免疫活性细胞在受到抗原信息的刺激后，发生母细胞化，进而大量增殖。由于抗原的性质不同，刺激T细胞分化成致敏淋巴细胞；刺激B细胞使其分化成浆细胞。在分化过程中小部分成为“记忆”细胞。由于“记忆”细胞的存在，即使抗原在浆内消失很久(数月至数年或更长)以后，仍能与再度进入体内的相应抗原迅速引起较强的免疫反应(回忆反应)。③效应阶段(发生免疫反应阶段)：当致敏淋巴细胞再次遇到相应抗原的刺激后，能释放出多种具有生物活性的物质(淋巴因子)，参与细胞免疫反应；浆细胞可形成各种类型的免疫球蛋白(抗体)，参与体液免疫反应。在免疫期间，不同的动物，在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等均可能发生变化，因此必须设计试验进行测定，以确定其变化规律[5]。

抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。免疫剂量过低不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。本试验抗原为颗粒性抗原，依据其强弱、分子量大小、动物个体情况及免疫时间间隔分别选择全细胞疫苗浓度1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL三个剂量[6]。

对免疫途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，以能使机体获得最好免疫效果为原则。根据不同抗原及试验要求，可选取皮内、皮下、肌肉注射、静脉或淋巴结等不同途径进行免疫；凡能造成全身性感染的疾病，以皮下或肌肉注射为好；而主要侵入呼吸道或体表感染的疾病，以喷雾接种疫苗的效果好；以消化道为入侵途径的感染或消化道感染，则以口服接种方式为好[7]。

两次注射的间隔时间应长短适宜，太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用[8]。一般初次免疫应答时间为7～10天左右，分泌IgM抗体；二次免疫应答在隔周；初次免疫应答以后1周达到峰值，分泌IgG抗体。因此应当选择二次免疫应答时进行免疫可能会有较好的免疫效果。在一定范围内，接种次数增加，免疫效果增强，但过多也会产生免疫麻痹现象[9]。

为了确保得到理想的试验结果，本次试验在免疫过程中分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂来增强机体对淋病奈瑟菌灭活疫苗的特异性免疫应答，其中初次免疫应用弗氏完全佐剂，即在弗氏不完全佐剂中加入BCG，为避免佐剂对全细胞疫苗抗原可能产生的破坏，进而影响免疫效果[10]，佐剂与抗原分别注入家兔体内，且接种部位在抗原附近或对侧。

通过上述试验条件的筛选，经过正交表L9(34)确定试验方案进行动物免疫，根据颗粒性抗原与抗体反应可以产生肉眼可见的凝集反应的特征，采用凝集试验进行免疫血清效价测定，各免疫组家兔的抗体结果表明：免疫剂量、免疫途径及免疫时间间隔三个因素对淋病奈瑟菌全细胞疫苗免疫效果均有影响；三者对免疫效价影响程度顺序为免疫剂量>免疫途径>免疫时间间隔；不同免疫剂量免疫效价存在差异：抗原浓度1×107CFU/mL免疫动物后血清中抗体效价几何均值为4.6357，抗原浓度1×108CFU/mL免疫动物后血清中抗体效价几何均值为5.7196，抗原浓度1×109CFU/mL免疫动物后血清中抗体效价几何均值为6.0206，其中浓度为1×109CFU/mL免疫效价最高，与其他两种浓度抗原产生的免疫效价相比，差异具有统计学意义。不同免疫途径的免疫效价同样存在差异：皮内注射免疫动物后血清中抗体效价几何均值为5.7195，肌肉注射免疫动物后血清中抗体效价几何均值为5.4185，皮下注射免疫动物后血清中抗体效价几何均值则为5.2379，皮内注射免疫效价高于其他两种途径，差异具有统计学意义。初次免疫与第二次加强免疫的时间间隔对家兔抗体的产生也有所不同：免疫间隔2周时免疫动物后血清中抗体效价几何均值为5.2379，间隔3周时免疫动物后血清中抗体效价几何均值为5.5991，4周时免疫动物后血清中抗体效价几何均值为5.5389，其中二次间隔为3周时免疫效价高于其他两种间隔时间，差异具有统计学意义。研究结果得到最佳免疫组合方式为：淋病奈瑟菌全细胞疫苗剂量1×109CFU/mL、初次与二次免疫间隔为3周、皮内注射的方式进行免疫。

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(2016-12-2 收稿)(张爱国 编辑)

Optimaization of inactived neisseria gonorrhoeae vaccination by orthogonal design

LILin,CHAOHongmei,PEIYinhui

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To optimize inactived neisseria gonorrhoeae vaccination by orthogonal design,so to establish experiment basis for further test. Methods Gonorrhea neisseria bacteria was diluted into 1×109CFU/mL,1×108CFU/mL and 1×107CFU/mL respectively,intradermal injection,intramuscular injection and subcutaneous injection were adopted for antigen entrance 2,3,4 weeks were the intervals between primary and second immune.Immunization was performed according to the orthogonal design table L9 (34).Slide agglutination test was performed to test the specific antibody titer of each groups 7 days later. Results The geometry means at the following cell density1×109CFU/mL,1×108CFU/mL and 1×107CFU/mL were 4.6357,5.7196 and 6.0206 respectively，the geometry mean with 1×109CFU/mL was higher than the others,and the difference was significantly.The geometry means with intradermal injection,intramuscular injection and subcutaneous injection were 5.7195,5.4185 and 5.2379 respectively,the geometry mean with intradermal injection was higher than the others,and the difference was significantly.The geometry means with 2,3 and 4 weeks were 5.2379,5.5991 and 5.5389 respectively,the geometry mean with 3 weeks interval was higher than the others, and the difference was significantly.Conclusion With the dosage of 109CFU/mL bacteria,intradermal injection,and 3 weeks interval between the first and the second injection are the optimization immune combination.

李 琳(1964-)，女，本科，高级实验师。研究方向：病原生物学。

R 392.3

A

2095-2694(2017)02-085-5