吴锦波，叶小汉，冼绍祥，董明国

基础与实验研究

比索洛尔改善心力衰竭大鼠心功能的机制探讨

吴锦波，叶小汉，冼绍祥，董明国

目的：观察比索洛尔对心力衰竭大鼠心功能的影响，并探讨其机制。

心力衰竭；肌细胞，心脏；微小核糖核酸

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:274.)

慢性心力衰竭（CHF）是多种心血管疾病的终末期表现，心力衰竭归根究底是心肌收缩和（或）舒张功能受损，心肌细胞兴奋-收缩耦联障碍。肌浆网钙ATP酶2a （SERCA2a）对兴奋-收缩耦联具有重要调控作用。动物实验和临床试验表明，转SERCA2a基因治疗可以改善实验动物和CHF患者的心功能[1、2]；抑制微小核糖核酸-25（miR-25）表达也可以提高SERCA2a表达水平，改善心功能[3]。β受体阻滞剂可以上调衰竭心脏β1受体并恢复其正常功能，改善心功能，提高左心室射血分数（LVEF）。β受体阻滞剂常与血管紧张素转换酶抑制剂联合应用，已经成为治疗CHF的基石[4]。研究发现：美托洛尔可以使衰竭心脏SERCA2a的蛋白水平和活性正常化[5]，这是美托洛尔治疗CHF的分子机制之一。CIBIS-Ⅱ临床试验显示，比索洛尔能降低CHF患者的病死率和再住院率[6]。然而，关于比索洛尔治疗CHF的分子机制研究报道较少。本实验通过腹腔注射阿霉素建立CHF大鼠模型，观察比索洛尔对大鼠心功能和SERCA2a活性的影响，并探讨其对SERCA2a、受磷蛋白（PLB）和miR-25-3p表达水平的影响，进一步探讨比索洛尔治疗CHF的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性SD大鼠80只，平均体质量（230±20） g，由广州中医药大学动物实验中心提供[动物许可证号：SCXK（粤）2013-0020；动物合格证号：440059000]。SPF级净化空间，生长条件为12 h/12 h光照周期，温度（22±3） ℃，相对湿度40%～70%，自由摄食、饮水。实验药物采用指南[1]推荐剂量，并经过人与大鼠体表面积换算。比索洛尔（德国Merck Serono，批号：191839）189 mg加无菌蒸馏水2100 ml，制成浓度为0.09 mg/ml的溶液，灌胃剂量为0.9 mg/（kg·d）。卡托普利（中美上海施贵宝，批号：AAB9465）2205 mg加无菌蒸馏水2100 ml，制成浓度为1.05 mg/ml的溶液，灌胃剂量为10.5 mg/（kg·d）。阿霉素（美国Medchemexpress LLC，批号：HY-15142）；氯胺酮（福建古田药业，批号：1504153）；地西泮（天津金耀药业，批号：1507077）。

主要试剂：酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自美国RayBiotech公司；超微量Ca2+-ATP酶检测试剂盒由南京建成提供；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒由碧云天生物技术研究所提供；β-actin抗体、SERCA2a抗体由美国Santa Cruz公司提供；PLB抗体购自美国Abgent公司；miR-25-3p反义探针购自上海GenePharma公司；U6反义探针购自美国Sigma公司；增强型化学发光液（ ECL）购自美国Millipore公司。逆转录-聚合酶链式反应（RTPCR）试剂由德国DBI公司提供。

主要仪器：HP5500心脏超声仪（美国惠普）；GDS7600凝胶扫描系统（英国UVP公司）；ABI9700PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.2 动物造模、分组及检测指标

雄性SD大鼠适应性喂养1周后，参照文献[7]，采用阿霉素腹腔注射法（用灭菌注射用水溶解成0.25 mg/ml溶液，每次注射剂量为2.5 mg/kg，2周内分6次注射，总剂量15 mg/kg）建立CHF大鼠模型。首次腹腔注射5周后应用心脏超声仪检测并计算左心室短轴缩短率（FS），以心腔扩大，FS＜30%作为CHF成模标准。

80只大鼠随机选取10只为正常对照组，10只作为假手术组，假手术组腹腔注射10 ml/kg的生理盐水。采用阿霉素腹腔注射法造模共60只，造模过程中有15只大鼠因出现重度心力衰竭和肝硬化腹水而死亡，死亡率为25%；FS不达标5只，成模率为67%。40只成功造模大鼠按随机数字表法分成4组：模型组（n=10）、比索洛尔组（n=10）、卡托普利组（n=10）和比索洛尔＋卡托普利组（n=10），后三组分别以比索洛尔[0.9 mg/（kg·d）]、卡托普利[10.5 mg/（kg·d）]和比索洛尔[0.9 mg/（kg·d）]＋卡托普利[10.5 mg/（kg·d）]灌胃，每天1 次，连续35天；其余各组以10 ml/kg的蒸馏水灌胃。在随后的实验干预中，每组各有1只大鼠因灌胃不当而死亡。

大鼠心功能指标检测：干预前后采用腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和地西泮（5 mg/kg）混合麻醉大鼠，胸前剃毛，大鼠取仰卧位，固定在木板上，应用心脏超声仪，分别测量左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）等，计算FS、心排出量（CO）和LVEF。

ELISA法检测血浆B型利钠肽（BNP）水平：处死大鼠时腹主动脉取血，肝素抗凝，静置1 h，300×g离心10 min，取上清－20℃冰箱保存，按试剂盒说明书进行操作。

茎环状引物实时定量RT-PCR检测大鼠心肌miR-25-3p表达水平：取大鼠心室肌组织100 mg匀浆后，用Trizol法抽提心肌总RNA。逆转录反应获得c DNA，茎环状引物实时定量PCR测定miR-25-3p的表达量。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，PCR 扩增40循环。电泳、凝胶成像，软件分析。以U6作为内参，以2-△△Ct公式计算miR-25-3p的相对表达水平。引物设计及PCR反应均由广州维伯鑫生物科技有限公司完成。PCR引物见表1。

表1 茎环状引物实时定量逆转录-聚合酶链式反应引物

免疫蛋白印迹法（Western blot）检测心肌细胞SERCA2a和PLB的蛋白表达水平：取100 mg心肌组织，加入裂解液，冰上裂解1 h，提取细胞内蛋白，用BCA法进行蛋白定量[8]。取各组蛋白样品进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用牛血清蛋白封闭，经Ⅰ抗结合后洗膜，Ⅱ抗结合，洗膜后采用ECL显色，软件分析。以SERCA2a和PLB的平均灰度值与相应内参照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，计算SERCA2a/PLB比值。

定磷法测定SERCA2a活性：参照文献[9]测定心肌ESRCA2a活性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件包进行统计学分析。计数资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，SLD法进行组间两两比较，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

CHF大鼠出现不同程度的食欲减退、精神较差、张口呼吸和乏力等症状。模型组、比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔＋卡托普利组术后体重分别为（325.0+50.8）g、（338.6 ±57.4）g、（341.3 ±51.5）g和（334.7±58.2）g，均明显低于正常对照组（443.2±69.3）g，差异有统计学意义（P＜0.01）；术后5周内模型组、比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔＋卡托普利组大鼠体重有不同程度回升，分别为（343.5±86.1）g、（475.2±32.7）g、（473.5±25.3）g和（480.4+25.5）g，比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔＋卡托普利组明显高于模型组（P＜0.01），差异有统计学意义。

2.2 各组大鼠心功能指标、血浆BNP水平比较（表2）

干预后，模型组FS、CO和LVEF明显低于正常对照组和假手术组（P＜0.01），差异有统计学意义；比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔＋卡托普利组FS、CO和LVEF明显高于模型组（P＜0.01），差异有统计学意义。模型组血浆BNP水平显著高于正常对照组和假手术组（P＜0.01），比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔＋卡托普利组显著低于模型组（P＜0.01），差异有统计学意义。

表2 各组大鼠心功能指标、血浆B型利钠肽水平比较

表2 各组大鼠心功能指标、血浆B型利钠肽水平比较

注：与正常对照组和假手术组比较*P＜0.01；与模型组比较△P＜0.01

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2.3 各组大鼠心肌miR-25-3p的表达水平比较（图1）

模型组miR-25-3p 表达水平明显高于正常对照组和假手术组（P＜0.01），卡托普利组、比索洛尔组和比索洛尔＋卡托普利组miR-25-3p 表达水平显著低于模型组（P＜0.01），差异有统计学意义。

图1 各组大鼠心肌miR-25-3p的相对表达水平比较（n=9）

2.4 各组大鼠心肌细胞SERCA2a和PLB的蛋白表达水平比较（图2）

模型组SERCA2a和PLB表达水平明显低于正常对照组（P＜0.01），降幅分别为83.5%和62.4%，SERCA2a降幅大于PLB，差异有统计学意义（P＜0.05）。比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔＋卡托普利组SERCA2a和PLB表达水平明显高于模型组（P＜0.01），升幅分别为315.3%和122.4%、201.8%和87.2%、311.3%和118.6%，SERCA2a升幅均大于PLB（P＜0.01）。比索洛尔组和比索洛尔＋卡托普利组SERCA2a/PLB比值[（6.16±0.34）和（6.05±0.35）]明显高于模型组（3.82±0.57），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.6 各组 大鼠心肌SERCA2a活性比较（图3）

模型组SERCA2a活性显著低于正常对照组和假手术组（P＜0.01），比索洛尔组和比索洛尔＋卡托普利组SERCA2a活性显著高于模型组（P＜0.05），差异有统计学意义。

图2 各组大鼠心肌细胞SERCA2a和PLB的相对表达水平的比较（n=9）

图3 各组大鼠心肌SERCA2a活性的比较（n=9）

3 讨论

大量的实验研究证明，SERCA2a具有正性肌力和正性变舒效应，能够提高心肌收缩力和改善舒张功能[1]。SERCA2a的含量与心脏指数、肺动脉压等血流动力学指标相关，与去甲肾上腺素正相关，与心钠素的mRNA含量负相关[10]。SERCA2a的含量还受miR-25的影响。研究发现：miR-25选择性作用于SERCA2a mRNA 3'非翻译区的结合位点，干扰SERCA2a 的合成从而降低其水平；通过给经主动脉缩窄术诱导的心衰小鼠注射Anti-miR-25可以降低miR-25水平，增加SERCA2a水平。miR-25-3p可能与miR-25一样，通过不精确的碱基配对与SERCA2a mRNA上的特异识别元件结合从而干扰其翻译[3]。心肌SERCA2a活性主要受PLB调控，PLB与SERCA2a结合可诱导其构象变化，减少SERCA2a与Ca2+的亲和力，降低肌浆网Ca2+摄取率；SERCA2a/PLB比值降低可以减弱SERCA2a活性[1]。

由于交感神经系统的长期过度激活，CHF患者心肌β1受体下调和功能受损，对儿茶酚胺的反应降低，心肌兴奋-收缩耦联功能障碍，心功能受损；β受体阻滞剂可以恢复β1受体功能并使之上调，心肌兴奋-收缩耦联趋于正常化，心功能得到改善[4]：β肾上腺素激活腺苷酸环化酶（cAMP），cAMP磷酸化并激活蛋白激酶（PKA），PKA磷酸化PLB导致SERCA2a抑制减弱，SERCA2a活性增强[1，4]。已有研究表明：美托洛尔可以使衰竭心脏SERCA2a的蛋白水平和活性正常化，减轻内质网应激，恢复Ca2+稳态，改善心功能[5]。

本实验中，CHF大鼠心肌SERCA2a和PLB表达水平降低，而比索洛尔可以提高SERCA2a和PLB表达水平，PLB的变化幅度较SERCA2a少。扩张型或缺血性心肌病患者心脏中，PLB mRNA的表达水平下降[1]，与本实验结果相符。与比索洛尔不同，美托洛尔对CHF狗模型的PLB没有明显的提升作用[5]，原因可能与药物不同、物种不同和造模方法不同有关。本实验中，CHF大鼠SERCA2a活性降低，究其原因可能有：（1）miR-25-3p抑制SERCA2a合成；（2）SERCA2a降幅大于PLB，SERCA2a/PLB比值降低，PLB抑制作用增强，SERCA2a活性降低，这在人类的衰竭心脏中亦有类似变化[11]。比索洛尔增强SERCA2a活性的可能机制有：（1）提高SERCA2a和PLB的表达水平，SERCA2a升幅大于PLB，SERCA2a/PLB比值升高，PLB的抑制作用减弱，SERCA2a活性增强；（2）miR-25-3p对SERCA2a的抑制作用减弱。本实验中，卡托普利也可以降低miR-25-3p，但其对SERCA2a的提升作用不如比索洛尔明显，对SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性的影响不明显；这也提示，SERCA2a除受miR-25-3p影响以外，还有其他途径（例如β1受体上调等）影响了SERCA2a的含量和活性。

本研究结果显示：比索洛尔可以提高SERCA2a含量和SERCA2a活性，这也许是比索洛尔治疗CHF的一种分子机制。必须指出：本实验使用动物样本量少，而且是小动物，只针对阿霉素诱导的特定心衰模型，比索洛尔的效应及其治疗心衰的分子机制有待大规模的动物实验和临床试验来进一步验证和解答。

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Exploration of Bisoprolol Improving Cardiac Function in Heart Failure Rats

WU Jin-bo, YE Xiao-han, XIAN Shao-xiang, DONG Ming-guo.
Department of Cardiology, Central Hospital of Dongguan City, Dongguan (510405), Guangdong, China Corresponding Author: WU Jin-bo, Email: wujinbocn@163.com

Objective: To observe the effect of bisoprolol on cardiac function in heart failure (HF) rats and to explore the mechanism.Methods: The experimental rats were divided into 6 groups: Control group, with normal healthy rats, Sham group, the rats received intraperitoneal injection of normal saline; chronic heart failure (CHF) model was successfully established in 40 rats and divided into 4 groups: CHF group, CHF+bisoprolol (Bis) group, CHF+captopril (Cap) group and CHF+Bis and Cap group.n=10 in each group. The cardiac function was observed among different groups; plasma BNP level was measured by ELISA, myocardial miR-25-3p expression was examined by RT-PCR, protein expressions of SERCA2a and phospholamban (PLB) were detected by Western blot analysis and SERCA2a activity was determined by inorganic phosphorus method.Results: Compared with Control group, CHF group showed decreased cardiac output (CO), left ventricular fractional shortening (LVFS), left ventricular ejection fraction (LVEF), reduced expression of cardiac SERCA2a, PLB, the ratio of SERCA2a/PLB and SERCA2a activity; while increased plasma BNP and miR-25-3p expression, allP＜0.01. Compared with CHF group, CHF+Bis, CHF+Cap and CHF+Bis and Cap groups had increased CO, LVFS, LVEF, elevated expression of cardiac SERCA2a, PLB, the ratio of SERCA2a/PLB and SERCA2a activity; while decreased plasma BNP and miR-25-3p expression, allP＜0.05.Conclusion: Bisoprolol could improve cardiac function in HF rats, which might be related to down regulating myocardial miR-25-3p expression, up regulating myocardial protein expressions of SERCA2a, PLB and enhancing SERCA2a activity.

Heart failure; Myocyte, cardiac; MicroRNA

2016-07-21）

（编辑:许菁）

510405 广东省，东莞市中医院 心内科（吴锦波、叶小汉、董明国）；广州中医药大学第一附属医院 心内科（冼绍祥）

吴锦波 副主任医师 博士 研究方向为心力衰竭的诊治 Email: wujinbocn@163.com 通讯作者：吴锦波

R54

A

1000-3614（2017）03-0274-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.03.016

方法：80只SD大鼠随机选取10只为正常对照组，10只作为假手术组，假手术组腹腔注射10 ml/kg的生理盐水。造模过程中有15只死亡，左心室短轴缩短率不达标5只，40只成功造模大鼠按随机数字表法分成4组：模型组（n=10）、比索洛尔组（n=10）、卡托普利组（n=10）和比索洛尔＋卡托普利组（n=10）。观察各组大鼠心功能指标，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血浆B型利钠肽水平，实时定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测心肌miR-25-3p表达水平，免疫蛋白印迹试验（Western blot）检测心肌肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）和受磷蛋白（PLB）表达水平，定磷法测定心肌SERCA2a活性。

结果：与正常对照组比较，模型组大鼠心输出量、左心室短轴缩短率、左心室射血分数、心肌SERCA2a和PLB表达水平、SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性显著降低，血浆B型利钠肽水平和心肌miR-25-3p表达水平显著升高（P均＜0.01）。与模型组比较，比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔＋卡托普利组大鼠心输出量、左心室短轴缩短率、左心室射血分数、心肌SERCA2a和PLB表达水平、SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性显著升高，血浆B型利钠肽水平和心肌miR-25-3p表达水平显著降低（P均＜0.05）。

结论：比索洛尔可以改善心力衰竭大鼠心功能，机制可能与下调心肌miR-25-3p表达，提高SERCA2a和PLB表达，提升SERCA2a/PLB比值，增强SERCA2a活性有关。